论文部分内容阅读
[摘要] 目的 探讨1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）对小鼠黑质多巴胺能神经元兴奋性的影响。
方法选用出生15～20 d的C57BL/6小鼠制备脑片，运用脑片全细胞膜片钳技术观察MPP+对黑质多巴胺能神经元自发放电及诱发放电的影响。
結果当小鼠黑质脑片灌流10 μmol/L MPP+5 min后，多巴胺能神经元自发放电频率明显升高（t=3.443，P<0.05）;灌流15 min左右，多巴胺能神经元自发放电频率显著减慢（t=4.172，P<0.01）;延长灌流时间至25 min左右时，多巴胺能神经元的放电活动可被完全抑制。在灌流MPP+5 min后，多巴胺能神经元诱发放电频率明显升高（t=4.472，P<0.05），峰电位间隔时间明显缩短（t=48.390，P<0.01）。
结论MPP+能够以时间依赖性的方式抑制正常小鼠黑质多巴胺能神经元的兴奋性。
[关键词] 1-甲基-4-苯基吡啶;多巴胺能神经元;膜片钳术;小鼠
[中图分类号] R338.8
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2019）01-0010-04
EFFECT OF 1-METHYL-4-PHENYLPYRIDINIUM ON THE EXCITABILITY OF DOPAMINERGIC NEURONS IN THE SUBSTANTIA NIGRA IN MICE
CHANG Xiaoli， SHI Limin， XIE Junxia
（Department of Physiology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP+） on the excitability of dopami-nergic neurons in the substantia nigra in mice.
MethodsBrain slices were prepared with C57BL/6 mice aged 15-20 days， and the whole-cell patch clamp technique was used to observe the effect of MPP+ on spontaneous discharge and evoked discharge of dopaminergic neurons in the substantia nigra.
ResultsAfter the brain slices of the substantia nigra in mice were perfused with 10 μmol/L MPP+ for 5 min， there was a increase in the frequency of spontaneous discharge of dopaminergic neurons， the diffe-rence is statistically significant （t=3.443，P<0.05）; after perfusion for 15 min， there was a reduction in the frequency of spontaneous discharge of dopaminergic neurons ， the difference is statistically significant （t=4.172，P<0.01）; after perfusion for 25 min，the discharge of dopaminergic neurons was completely inhibited. After perfusion with MPP+ for 5 min， there was a significant increase in the frequency of evoked discharge of dopaminergic neurons （t=4.472，P<0.05） and a significant reduction in interspike interval （t=48.390，P<0.01）.
ConclusionMPP+ can inhibit the excitability of dopaminergic neurons in the substantia nigra in normal mice in a time-dependent manner.
[KEY WORDS]1-methyl-4-phenylpyridinium; dopaminergic neurons; patch-clamp technique; mice
LANGSTON等[1]于1982年发现，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）在人类能够导致类似帕金森病的症状，如运动迟缓、肌僵直、姿势不稳和静止性震颤等[2-4]。之后又有实验室在灵长类、啮齿类动物相继发现MPTP同样可诱导帕金森病的发生[5]。研究表明，MPTP可选择性地损伤黑质多巴胺能神经元，已经成为诱导帕金森病动物模型最常用的药物[6-7]。目前，对MPTP诱导产生帕金森病的作用机制研究主要集中在其对线粒体损伤上，认为MPTP是一种亲脂性的神经毒素，很容易透过血-脑脊液屏障，在神经胶质细胞内经单胺氧化酶B作用下，转变为活性代谢产物1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+），然后释放到细胞间隙被多巴胺能神经元上的多巴胺转运体选择性地重摄取[8-10]，MPP+在线粒体中积聚，抑制线粒体复合体Ⅰ，导致ATP不足、线粒体膜电位缺失、活性氧形成以及氧化应激等，最终导致细胞死亡[11-13]。之后又有文献报道，MPTP可通过激活自噬溶酶体途径损伤多巴胺能神经元[14-15]。然而，MPTP对多巴胺能神经元电活动的影响尚不清楚。鉴于黑质多巴胺能神经元有自发放电行为[16-17]，且放电活动的变化与多巴胺递质的释放量密切相关[18-21]，因此，阐明MPTP/MPP+对神经元电活动的影响至关重要。本研究旨在探讨急性灌流MPP+对黑质多巴胺能神经元自发放电和诱发放电的影响。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物 出生15～20 d的C57BL/6小鼠由苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司提供。动物的饲养和手术符合青岛大学动物伦理学要求。
1.1.2主要试剂 MPP+由美国Sigma公司提供，用三蒸水稀释至100 mmol/L溶液，在应用前稀释至10 mmol/L，-20 ℃保存。
1.1.3溶液配制 ①人工脑脊液（ACSF）配制：将3.0 mmol/L KCl、124.0 mmol/L NaCl、1.3 mmol/L Na2HPO4、1.3 mmol/L CaCl2、26.0 mmol/L NaHCO3、2.4 mmol/L MgCl2和10.0 mmol/L Glucose混合，调整pH值至7.4（用1 mol/L NaOH稀释），渗透压770 kPa（用渗透压测量仪进行测量），并持续通入含体积分数0.95 O2和体积分数0.05 CO2的混合气体进行氧合。②低钙切片液配制：将3.0 mmol/L KCl、124.0 mmol/L NaCl、1.3 mmol/L Na2HPO4、2.0 mmol/L CaCl2、26.0 mmol/L NaHCO3、1.0 mmol/L MgCl2和10.0 mmol/L Glucose混合，使用1 mol/L的NaOH调节溶液的pH值至7.4，渗透压为770 kPa（用渗透压测量仪检测），并持续通入含体积分数0.95 O2和体积分数0.05 CO2的混合气体进行氧合。③电极内液的配制：将10.0 mmol/L HEPES、120.0 mmol/L K-gluconate、20.0 mmol/L KCl、2.0 mmol/L MgCl2、10.0 mmol/L EGTA、2.0 mmol/L Na2ATP以及0.3 mmol/L的Na2GTP混合，用1 mmol/L KOH调节pH值至7.3，以500 μL分装后-20 ℃储存。
1.2 实验方法
1.2.1离体黑质脑片制备 制备方法参见文献[22]。
1.2.2脑片全细胞膜片钳电生理记录 将离体脑片转移至持续灌流ACSF的浴槽内，ASCF持续通入含体积分数0.95 O2及体积分数0.05 CO2的混合气体，并选择状态良好、边界清晰的细胞进行全细胞膜片钳记录。将抛光的玻璃微电极（其电阻为5～10 MΩ）注入电极内液并使电极尖端进入液面以下。当电极尖端接近细胞表面并在细胞表面压出类似“酒窝”的形状时（此时电流变小，电阻慢慢变大），迅速释放正压，使细胞膜快速达到千兆封接。如果电阻没有达到千兆，则通过注射器给予细胞膜片一个负压，使之达到千兆封接，并补偿快电容。之后，采用负压法吸破电极与细胞相接触的膜片，使电极与细胞内液相通，并补偿慢电容。转换至电流钳模式，将电流钳置于0 pA，完成全细胞电流钳记录，判断是否为黑质多巴胺能神经元[19]。数据用Patchmaster软件采集并储存，用Minianalysis、Clamfit等软件进行分析。
1.3 统计学分析
应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，实验所得数据以[AKx-D]±s表示，同一个神经元灌流药物前后放电频率以及峰电位间隔时间的比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 MPP+对多巴胺能神经元自发放电活动影响
本实验共记录了6个黑质多巴胺能神经元，其自发放电的频率为（1.41±0.32）Hz，当灌流含有10 μmol/L MPP+的ASCF 5 min后，多巴胺能神经元自发放电频率为（2.30±0.43）Hz，与加药前相比较，放电频率明显增加，差异具有统计学意义（t=3.443，P<0.05）。继续灌流该药物，在灌流15 min左右时，多巴胺能神经元的自发放电频率为（0.78±0.21）Hz，与加药前相比较，放电频率显著减慢（t=4.172，P<0.01）。继续延长灌流时间至25 min左右，多巴胺能神经元的自发放电活动被完全抑制，应用ASCF冲洗脑片，有1个多巴胺能神经元的放电频率被完全恢复，其余的多巴胺能神经元均未能恢复自发放电活动。
2.2 MPP+对多巴胺能神经元诱发放电活动影响
本实验又记录了5个黑质多巴胺能神经元，并在电流钳下给予细胞膜30 pA的电流刺激，多巴胺能神经元诱发放电频率为（2.15±0.20）Hz，峰电位间隔时间为（0.19±0.11）s;在灌流10 μmol/L的MPP+5 min后，多巴胺能神经元诱发放电频率为（3.89±0.31）Hz，峰电位间隔时间为（0.11±0.13）s。与灌流药物前相比，多巴胺能神經元诱发放电频率显著增加（t=4.472，P<0.05），峰电位间隔时间显著缩短（t=48.390，P<0.01）。
3 讨 论
黑质多巴胺能神经元的电活动在黑质纹状体系统的功能调节以及帕金森病中发挥重要作用，其放电频率增加或放电模式向簇状放电的转换均促进多巴胺的释放，但兴奋性过度增高可引起多巴胺能神经元的死亡。而放电频率降低1 Hz即可导致多巴胺的释放下降10%，影响机体的运动功能[23-24]。因此，阐明神经毒素或其他致病因素对黑质多巴胺能神经元放电活动的影响，对于研究帕金森病的病理机制及治疗措施是极其关键的。
本研究选用低浓度（10 μmol/L）的MPP+急性灌流黑质多巴胺能神经元，结果表明，MPP+对多巴胺能神经元电活动的抑制作用具有时间依赖性。在开始灌流的5 min左右，多巴胺能神经元的自发放电频率是明显增加的，但随着灌流时间的延长，多巴胺能神经元的放电频率开始显著减慢甚至被完全抑制。MASI等[25]的研究结果显示，使用50 μmol/L的MPP+灌流黑质脑片时，多巴胺能神经元的放电频率可在5 min左右受到明显抑制，并没有出现短时间的多巴胺能神经元放电频率增加。目前的研究认为，MPP+主要通过在线粒体聚集，抑制线粒体复合体Ⅰ，引起ATP不足，激活钾离子通道、HCN通道等多种离子通道，导致多巴胺能神经元放电活动减慢[25-26]。我们推测，当低浓度的MPP+短时间作用于多巴胺能神经元时，多巴胺能神经元处于应激状态，通过提高自身兴奋性释放较多的多巴胺递质来进行自身保护。随着灌流时间延长，更多MPP+进入多巴胺能神经元并在线粒体中聚集，对线粒体的损伤作用增强，超出多巴胺能神经元的代偿能力，因此，随着灌流MPP+时间的延长，多巴胺能神经元的放电频率被逐渐抑制。高浓度的MPP+可快速进入多巴胺能神经元，对线粒体的损伤作用强，在很短的时间内就可以明显抑制多巴胺能神经元的放电活动。在灌流MPP+5 min时，多巴胺能神经元的诱发放电频率显著增加，峰电位间隔时间显著缩短，进一步支持低浓度的MPP+可在短时间内增强黑质多巴胺能神经元的兴奋性。 之前的研究表明，神經毒素MPTP/MPP+抑制线粒体复合体Ⅰ，引起活性氧的增多和细胞凋亡，许多肽类或激动剂可通过抗凋亡抗氧化途径发挥神经保护作用[27-29]。通过研究MPTP对黑质多巴胺能神经元电活动的调控，进一步完善了其对多巴胺能神经元损伤的作用机制，为帕金森病的治疗提供了新的方向。
[参考文献]
[1]LANGSTON J W， BALLARD P， TETRUD J W， et al. Chronic parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis[J]. Science（New York，N.Y.）， 1983，219（4587）：979-980.
[2]LANGSTON J W， LANGSTON E B， IRWIN I. MPTP-induced parkinsonism in human and non-human primates-clinical and experimental aspects[J]. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum， 1984，100（7）：49-54.
[3]李爱英，王辉明，章政，等. 黄芩苷对MPTP致帕金森病模型小鼠行为能力影响[J]. 青岛大学医学院学报， 2016，52（1）：46-48.
[4]ALEXOUDI A， ALEXOUDI I， GATZONIS S. Parkinson’s disease pathogenesis，evolution and alternative pathways：a review[J]. Revue Neurologique， 2018，174（10）：699-704.
[5]BURNS R S， CHIUEH C C， MARKEY S P， et al. A primate model of parkinsonism：selective destruction of dopaminergic neurons in the pars compacta of the substantia nigra by N-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1983，80（14）：4546-4550.
[6]FORNAI F， SCHLUTER O M， LENZI P， et al. Parkinson-like syndrome induced by continuous MPTP infusion：convergent roles of the ubiquitin-proteasome system and alpha-synuclein[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2005，102（9）：3413-3418.
[7]ZHANG Yunlong， LIU Yan， KANG Xinpan， et al. Ginse-noside Rb1 confers neuroprotection via promotion of glutamate transporters in a mouse model of Parkinson’s disease[J]. Neuropharmacology， 2018，131（25）：223-237.
[8]FULLER R W， HEMRICK-LUECKE S K. Mechanisms of MPTP （1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine） neurotoxicity to striatal dopamine neurons in mice[J]. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry， 1985，9（5/6）：687-690.
[9]IRWIN I，LANGSTON J W. Selective accumulation of MPP+ in the substantia nigra：a key to neurotoxicity[J]？ Life Sciences， 1985，36（3）：207-212.
[10]HUANG Dongping， XU Jing， WANG Jinghui， et al. Dynamic changes in the nigrostriatal pathway in the MPTP mouse mo-del of Parkinson’s disease[J]. Parkinson’s Disease， 2017， 2017（1）：1-7.
[11]SMEYNE R J， JACKSON-LEWIS V. The MPTP model of Parkinson’s disease[J]. Brain Research. Molecular Brain Research， 2005，134（1）：57-66.
[12]LEE S B， KIM H T， YANG H O， et al. Anodal transcranial direct current stimulation prevents methyl-4phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP）-induced neurotoxicity by modulating autophagy in an in vivo mouse model of Parkinson’s di-sease[J]. Scientific Reports， 2018，8（1）：15165. [13]王月华，张峥，侯琳，等. MPTP细胞损伤模型中Ca2+浓度和β-链蛋白表达变化[J]. 青岛大学医学院学报， 2016，52（3）：253-256.
[14]LI Huan， JANG W， KIM H J， et al. Biochemical protective effect of 1，25-dihydroxyvitamin D-3 through autophagy induction in the MPTP mouse model of Parkinson’s disease[J]. NeuroReport， 2015，26（12）：669-674.
[15]SU Lingyan， LI Hao， LV Li， et al. Melatonin attenuates MPTP-induced neurotoxicity via preventing CDK5-mediated autophagy and SNCA/α-synuclein aggregation[J]. Autophagy， 2015，11（10）：1745-1759.
[16]KIMM T， KHALIQ Z M， BEAN B P. Differential regulation of action potential shape and burst-frequency firing by BK and Kv2 channels in substantia nigra dopaminergic neurons[J]. Journal of Neuroscience， 2015，35（50）：16404-16417.
[17]MEZA R C， LOPEZ-JURY L. Role of the axon initial segment in the control of spontaneous frequency of nigral dopaminergic neurons in vivo[J]. J Neurosci， 2018，38（3）：733-744.
[18]HANSEN H H， ANDREASEN J T， WEIKOP P A， et al. The neuronal KCNQ channel opener retigabine inhibits locomotor activity and reduces forebrain excitatory
responses to the psycho stimulants cocaine，methylphenidate and phencyclidine[J]. European Journal of Pharmacology， 2007，570（1/3）：77-88.
[19]SHI Limin， BIAN Xiling， QU Zhiqiang， et al. Peptide hormone ghrelin enhances neuronal excitability by inhibition of Kv7/KCNQ channels[J]. Nature Communications， 2013，4（2）：1435-1447.
[20]AVERSA D， MARTINI A， GUATTEO E， et al. Reversal of dopamine-mediated firing inhibition through activation of the dopamine transporter in substantia nigra pars compacta neurons[J]. British Journal of Pharmacology， 2018，175（17）：3534-3547.
[21]CANAVIER C C， EVANS R C， OSTER A M， et al. Implications of cellular models of dopamine neurons for disease[J]. Journal of Neurophysiology， 2016，116（6）：2815-2830.
[22]薛宝，常晓丽，贾璐，等. Ghrelin抑制A型钾通道电流对小鼠黑质多巴胺能神经元兴奋性的影响[J]. 青岛大学学报（医学版）， 2018，54（2）：127-129，133.
[23]SURMEIER D J， SCHUMACKER P T. Calcium，bioenerge-tics， and neuronal vulnerability in Parkinson’s disease[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2013，288（15）：10736-10741.
[24]DRAGICEVIC E， SCHIEMANN J， LISS B. Dopamine midbrain neurons in health and Parkinson’s disease：emerging roles of voltage-gated calcium channels and ATP-sensitive potassium channels[J]. Neuroscience， 2015，284（54）：798-814.
[25]MASI A， NARDUCCI R， LANDUCCI E， et al. MPP+-dependent inhibition of Ih reduces spontaneous activity and enhances EPSP summation in nigral dopamine neurons[J]. British Journal of Pharmacology， 2013，169（1）：130-142.
[26]YEE A G， LEE S M， HUNTER M R， et al. Effects of the Parkinsonian toxin MPP+ on electrophysiological properties of nigral dopaminergic neurons[J]. NeuroToxicology， 2014，45（4）：1-11.
[27]李林靜，姜宏，王俊，等. Ghrelin 对MPTP小鼠帕金森病模型黑质TH、Bcl-2和Bax mRNA表达的影响[J]. 青岛大学医学院学报， 2007，43（4）：283-285，288.
[28]CHEN H， XU J， LV Y， et al. Proanthocyanidins exert a neuroprotective effect via ROS/JNK signaling in MPTPinduced Parkinson’s disease models in vitro and in vivo[J]. Molecular Medicine Reports， 2018，18（6）：4913-4921.
[29]冯晓庆，袁良杰，惠雅，等. E2对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤保护作用及G15的阻断效应[J]. 青岛大学学报（医学版）， 2018，54（1）：6-9.
方法选用出生15～20 d的C57BL/6小鼠制备脑片，运用脑片全细胞膜片钳技术观察MPP+对黑质多巴胺能神经元自发放电及诱发放电的影响。
結果当小鼠黑质脑片灌流10 μmol/L MPP+5 min后，多巴胺能神经元自发放电频率明显升高（t=3.443，P<0.05）;灌流15 min左右，多巴胺能神经元自发放电频率显著减慢（t=4.172，P<0.01）;延长灌流时间至25 min左右时，多巴胺能神经元的放电活动可被完全抑制。在灌流MPP+5 min后，多巴胺能神经元诱发放电频率明显升高（t=4.472，P<0.05），峰电位间隔时间明显缩短（t=48.390，P<0.01）。
结论MPP+能够以时间依赖性的方式抑制正常小鼠黑质多巴胺能神经元的兴奋性。
[关键词] 1-甲基-4-苯基吡啶;多巴胺能神经元;膜片钳术;小鼠
[中图分类号] R338.8
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2019）01-0010-04
EFFECT OF 1-METHYL-4-PHENYLPYRIDINIUM ON THE EXCITABILITY OF DOPAMINERGIC NEURONS IN THE SUBSTANTIA NIGRA IN MICE
CHANG Xiaoli， SHI Limin， XIE Junxia
（Department of Physiology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP+） on the excitability of dopami-nergic neurons in the substantia nigra in mice.
MethodsBrain slices were prepared with C57BL/6 mice aged 15-20 days， and the whole-cell patch clamp technique was used to observe the effect of MPP+ on spontaneous discharge and evoked discharge of dopaminergic neurons in the substantia nigra.
ResultsAfter the brain slices of the substantia nigra in mice were perfused with 10 μmol/L MPP+ for 5 min， there was a increase in the frequency of spontaneous discharge of dopaminergic neurons， the diffe-rence is statistically significant （t=3.443，P<0.05）; after perfusion for 15 min， there was a reduction in the frequency of spontaneous discharge of dopaminergic neurons ， the difference is statistically significant （t=4.172，P<0.01）; after perfusion for 25 min，the discharge of dopaminergic neurons was completely inhibited. After perfusion with MPP+ for 5 min， there was a significant increase in the frequency of evoked discharge of dopaminergic neurons （t=4.472，P<0.05） and a significant reduction in interspike interval （t=48.390，P<0.01）.
ConclusionMPP+ can inhibit the excitability of dopaminergic neurons in the substantia nigra in normal mice in a time-dependent manner.
[KEY WORDS]1-methyl-4-phenylpyridinium; dopaminergic neurons; patch-clamp technique; mice
LANGSTON等[1]于1982年发现，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）在人类能够导致类似帕金森病的症状，如运动迟缓、肌僵直、姿势不稳和静止性震颤等[2-4]。之后又有实验室在灵长类、啮齿类动物相继发现MPTP同样可诱导帕金森病的发生[5]。研究表明，MPTP可选择性地损伤黑质多巴胺能神经元，已经成为诱导帕金森病动物模型最常用的药物[6-7]。目前，对MPTP诱导产生帕金森病的作用机制研究主要集中在其对线粒体损伤上，认为MPTP是一种亲脂性的神经毒素，很容易透过血-脑脊液屏障，在神经胶质细胞内经单胺氧化酶B作用下，转变为活性代谢产物1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+），然后释放到细胞间隙被多巴胺能神经元上的多巴胺转运体选择性地重摄取[8-10]，MPP+在线粒体中积聚，抑制线粒体复合体Ⅰ，导致ATP不足、线粒体膜电位缺失、活性氧形成以及氧化应激等，最终导致细胞死亡[11-13]。之后又有文献报道，MPTP可通过激活自噬溶酶体途径损伤多巴胺能神经元[14-15]。然而，MPTP对多巴胺能神经元电活动的影响尚不清楚。鉴于黑质多巴胺能神经元有自发放电行为[16-17]，且放电活动的变化与多巴胺递质的释放量密切相关[18-21]，因此，阐明MPTP/MPP+对神经元电活动的影响至关重要。本研究旨在探讨急性灌流MPP+对黑质多巴胺能神经元自发放电和诱发放电的影响。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物 出生15～20 d的C57BL/6小鼠由苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司提供。动物的饲养和手术符合青岛大学动物伦理学要求。
1.1.2主要试剂 MPP+由美国Sigma公司提供，用三蒸水稀释至100 mmol/L溶液，在应用前稀释至10 mmol/L，-20 ℃保存。
1.1.3溶液配制 ①人工脑脊液（ACSF）配制：将3.0 mmol/L KCl、124.0 mmol/L NaCl、1.3 mmol/L Na2HPO4、1.3 mmol/L CaCl2、26.0 mmol/L NaHCO3、2.4 mmol/L MgCl2和10.0 mmol/L Glucose混合，调整pH值至7.4（用1 mol/L NaOH稀释），渗透压770 kPa（用渗透压测量仪进行测量），并持续通入含体积分数0.95 O2和体积分数0.05 CO2的混合气体进行氧合。②低钙切片液配制：将3.0 mmol/L KCl、124.0 mmol/L NaCl、1.3 mmol/L Na2HPO4、2.0 mmol/L CaCl2、26.0 mmol/L NaHCO3、1.0 mmol/L MgCl2和10.0 mmol/L Glucose混合，使用1 mol/L的NaOH调节溶液的pH值至7.4，渗透压为770 kPa（用渗透压测量仪检测），并持续通入含体积分数0.95 O2和体积分数0.05 CO2的混合气体进行氧合。③电极内液的配制：将10.0 mmol/L HEPES、120.0 mmol/L K-gluconate、20.0 mmol/L KCl、2.0 mmol/L MgCl2、10.0 mmol/L EGTA、2.0 mmol/L Na2ATP以及0.3 mmol/L的Na2GTP混合，用1 mmol/L KOH调节pH值至7.3，以500 μL分装后-20 ℃储存。
1.2 实验方法
1.2.1离体黑质脑片制备 制备方法参见文献[22]。
1.2.2脑片全细胞膜片钳电生理记录 将离体脑片转移至持续灌流ACSF的浴槽内，ASCF持续通入含体积分数0.95 O2及体积分数0.05 CO2的混合气体，并选择状态良好、边界清晰的细胞进行全细胞膜片钳记录。将抛光的玻璃微电极（其电阻为5～10 MΩ）注入电极内液并使电极尖端进入液面以下。当电极尖端接近细胞表面并在细胞表面压出类似“酒窝”的形状时（此时电流变小，电阻慢慢变大），迅速释放正压，使细胞膜快速达到千兆封接。如果电阻没有达到千兆，则通过注射器给予细胞膜片一个负压，使之达到千兆封接，并补偿快电容。之后，采用负压法吸破电极与细胞相接触的膜片，使电极与细胞内液相通，并补偿慢电容。转换至电流钳模式，将电流钳置于0 pA，完成全细胞电流钳记录，判断是否为黑质多巴胺能神经元[19]。数据用Patchmaster软件采集并储存，用Minianalysis、Clamfit等软件进行分析。
1.3 统计学分析
应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，实验所得数据以[AKx-D]±s表示，同一个神经元灌流药物前后放电频率以及峰电位间隔时间的比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 MPP+对多巴胺能神经元自发放电活动影响
本实验共记录了6个黑质多巴胺能神经元，其自发放电的频率为（1.41±0.32）Hz，当灌流含有10 μmol/L MPP+的ASCF 5 min后，多巴胺能神经元自发放电频率为（2.30±0.43）Hz，与加药前相比较，放电频率明显增加，差异具有统计学意义（t=3.443，P<0.05）。继续灌流该药物，在灌流15 min左右时，多巴胺能神经元的自发放电频率为（0.78±0.21）Hz，与加药前相比较，放电频率显著减慢（t=4.172，P<0.01）。继续延长灌流时间至25 min左右，多巴胺能神经元的自发放电活动被完全抑制，应用ASCF冲洗脑片，有1个多巴胺能神经元的放电频率被完全恢复，其余的多巴胺能神经元均未能恢复自发放电活动。
2.2 MPP+对多巴胺能神经元诱发放电活动影响
本实验又记录了5个黑质多巴胺能神经元，并在电流钳下给予细胞膜30 pA的电流刺激，多巴胺能神经元诱发放电频率为（2.15±0.20）Hz，峰电位间隔时间为（0.19±0.11）s;在灌流10 μmol/L的MPP+5 min后，多巴胺能神经元诱发放电频率为（3.89±0.31）Hz，峰电位间隔时间为（0.11±0.13）s。与灌流药物前相比，多巴胺能神經元诱发放电频率显著增加（t=4.472，P<0.05），峰电位间隔时间显著缩短（t=48.390，P<0.01）。
3 讨 论
黑质多巴胺能神经元的电活动在黑质纹状体系统的功能调节以及帕金森病中发挥重要作用，其放电频率增加或放电模式向簇状放电的转换均促进多巴胺的释放，但兴奋性过度增高可引起多巴胺能神经元的死亡。而放电频率降低1 Hz即可导致多巴胺的释放下降10%，影响机体的运动功能[23-24]。因此，阐明神经毒素或其他致病因素对黑质多巴胺能神经元放电活动的影响，对于研究帕金森病的病理机制及治疗措施是极其关键的。
本研究选用低浓度（10 μmol/L）的MPP+急性灌流黑质多巴胺能神经元，结果表明，MPP+对多巴胺能神经元电活动的抑制作用具有时间依赖性。在开始灌流的5 min左右，多巴胺能神经元的自发放电频率是明显增加的，但随着灌流时间的延长，多巴胺能神经元的放电频率开始显著减慢甚至被完全抑制。MASI等[25]的研究结果显示，使用50 μmol/L的MPP+灌流黑质脑片时，多巴胺能神经元的放电频率可在5 min左右受到明显抑制，并没有出现短时间的多巴胺能神经元放电频率增加。目前的研究认为，MPP+主要通过在线粒体聚集，抑制线粒体复合体Ⅰ，引起ATP不足，激活钾离子通道、HCN通道等多种离子通道，导致多巴胺能神经元放电活动减慢[25-26]。我们推测，当低浓度的MPP+短时间作用于多巴胺能神经元时，多巴胺能神经元处于应激状态，通过提高自身兴奋性释放较多的多巴胺递质来进行自身保护。随着灌流时间延长，更多MPP+进入多巴胺能神经元并在线粒体中聚集，对线粒体的损伤作用增强，超出多巴胺能神经元的代偿能力，因此，随着灌流MPP+时间的延长，多巴胺能神经元的放电频率被逐渐抑制。高浓度的MPP+可快速进入多巴胺能神经元，对线粒体的损伤作用强，在很短的时间内就可以明显抑制多巴胺能神经元的放电活动。在灌流MPP+5 min时，多巴胺能神经元的诱发放电频率显著增加，峰电位间隔时间显著缩短，进一步支持低浓度的MPP+可在短时间内增强黑质多巴胺能神经元的兴奋性。 之前的研究表明，神經毒素MPTP/MPP+抑制线粒体复合体Ⅰ，引起活性氧的增多和细胞凋亡，许多肽类或激动剂可通过抗凋亡抗氧化途径发挥神经保护作用[27-29]。通过研究MPTP对黑质多巴胺能神经元电活动的调控，进一步完善了其对多巴胺能神经元损伤的作用机制，为帕金森病的治疗提供了新的方向。
[参考文献]
[1]LANGSTON J W， BALLARD P， TETRUD J W， et al. Chronic parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis[J]. Science（New York，N.Y.）， 1983，219（4587）：979-980.
[2]LANGSTON J W， LANGSTON E B， IRWIN I. MPTP-induced parkinsonism in human and non-human primates-clinical and experimental aspects[J]. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum， 1984，100（7）：49-54.
[3]李爱英，王辉明，章政，等. 黄芩苷对MPTP致帕金森病模型小鼠行为能力影响[J]. 青岛大学医学院学报， 2016，52（1）：46-48.
[4]ALEXOUDI A， ALEXOUDI I， GATZONIS S. Parkinson’s disease pathogenesis，evolution and alternative pathways：a review[J]. Revue Neurologique， 2018，174（10）：699-704.
[5]BURNS R S， CHIUEH C C， MARKEY S P， et al. A primate model of parkinsonism：selective destruction of dopaminergic neurons in the pars compacta of the substantia nigra by N-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1983，80（14）：4546-4550.
[6]FORNAI F， SCHLUTER O M， LENZI P， et al. Parkinson-like syndrome induced by continuous MPTP infusion：convergent roles of the ubiquitin-proteasome system and alpha-synuclein[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2005，102（9）：3413-3418.
[7]ZHANG Yunlong， LIU Yan， KANG Xinpan， et al. Ginse-noside Rb1 confers neuroprotection via promotion of glutamate transporters in a mouse model of Parkinson’s disease[J]. Neuropharmacology， 2018，131（25）：223-237.
[8]FULLER R W， HEMRICK-LUECKE S K. Mechanisms of MPTP （1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine） neurotoxicity to striatal dopamine neurons in mice[J]. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry， 1985，9（5/6）：687-690.
[9]IRWIN I，LANGSTON J W. Selective accumulation of MPP+ in the substantia nigra：a key to neurotoxicity[J]？ Life Sciences， 1985，36（3）：207-212.
[10]HUANG Dongping， XU Jing， WANG Jinghui， et al. Dynamic changes in the nigrostriatal pathway in the MPTP mouse mo-del of Parkinson’s disease[J]. Parkinson’s Disease， 2017， 2017（1）：1-7.
[11]SMEYNE R J， JACKSON-LEWIS V. The MPTP model of Parkinson’s disease[J]. Brain Research. Molecular Brain Research， 2005，134（1）：57-66.
[12]LEE S B， KIM H T， YANG H O， et al. Anodal transcranial direct current stimulation prevents methyl-4phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP）-induced neurotoxicity by modulating autophagy in an in vivo mouse model of Parkinson’s di-sease[J]. Scientific Reports， 2018，8（1）：15165. [13]王月华，张峥，侯琳，等. MPTP细胞损伤模型中Ca2+浓度和β-链蛋白表达变化[J]. 青岛大学医学院学报， 2016，52（3）：253-256.
[14]LI Huan， JANG W， KIM H J， et al. Biochemical protective effect of 1，25-dihydroxyvitamin D-3 through autophagy induction in the MPTP mouse model of Parkinson’s disease[J]. NeuroReport， 2015，26（12）：669-674.
[15]SU Lingyan， LI Hao， LV Li， et al. Melatonin attenuates MPTP-induced neurotoxicity via preventing CDK5-mediated autophagy and SNCA/α-synuclein aggregation[J]. Autophagy， 2015，11（10）：1745-1759.
[16]KIMM T， KHALIQ Z M， BEAN B P. Differential regulation of action potential shape and burst-frequency firing by BK and Kv2 channels in substantia nigra dopaminergic neurons[J]. Journal of Neuroscience， 2015，35（50）：16404-16417.
[17]MEZA R C， LOPEZ-JURY L. Role of the axon initial segment in the control of spontaneous frequency of nigral dopaminergic neurons in vivo[J]. J Neurosci， 2018，38（3）：733-744.
[18]HANSEN H H， ANDREASEN J T， WEIKOP P A， et al. The neuronal KCNQ channel opener retigabine inhibits locomotor activity and reduces forebrain excitatory
responses to the psycho stimulants cocaine，methylphenidate and phencyclidine[J]. European Journal of Pharmacology， 2007，570（1/3）：77-88.
[19]SHI Limin， BIAN Xiling， QU Zhiqiang， et al. Peptide hormone ghrelin enhances neuronal excitability by inhibition of Kv7/KCNQ channels[J]. Nature Communications， 2013，4（2）：1435-1447.
[20]AVERSA D， MARTINI A， GUATTEO E， et al. Reversal of dopamine-mediated firing inhibition through activation of the dopamine transporter in substantia nigra pars compacta neurons[J]. British Journal of Pharmacology， 2018，175（17）：3534-3547.
[21]CANAVIER C C， EVANS R C， OSTER A M， et al. Implications of cellular models of dopamine neurons for disease[J]. Journal of Neurophysiology， 2016，116（6）：2815-2830.
[22]薛宝，常晓丽，贾璐，等. Ghrelin抑制A型钾通道电流对小鼠黑质多巴胺能神经元兴奋性的影响[J]. 青岛大学学报（医学版）， 2018，54（2）：127-129，133.
[23]SURMEIER D J， SCHUMACKER P T. Calcium，bioenerge-tics， and neuronal vulnerability in Parkinson’s disease[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2013，288（15）：10736-10741.
[24]DRAGICEVIC E， SCHIEMANN J， LISS B. Dopamine midbrain neurons in health and Parkinson’s disease：emerging roles of voltage-gated calcium channels and ATP-sensitive potassium channels[J]. Neuroscience， 2015，284（54）：798-814.
[25]MASI A， NARDUCCI R， LANDUCCI E， et al. MPP+-dependent inhibition of Ih reduces spontaneous activity and enhances EPSP summation in nigral dopamine neurons[J]. British Journal of Pharmacology， 2013，169（1）：130-142.
[26]YEE A G， LEE S M， HUNTER M R， et al. Effects of the Parkinsonian toxin MPP+ on electrophysiological properties of nigral dopaminergic neurons[J]. NeuroToxicology， 2014，45（4）：1-11.
[27]李林靜，姜宏，王俊，等. Ghrelin 对MPTP小鼠帕金森病模型黑质TH、Bcl-2和Bax mRNA表达的影响[J]. 青岛大学医学院学报， 2007，43（4）：283-285，288.
[28]CHEN H， XU J， LV Y， et al. Proanthocyanidins exert a neuroprotective effect via ROS/JNK signaling in MPTPinduced Parkinson’s disease models in vitro and in vivo[J]. Molecular Medicine Reports， 2018，18（6）：4913-4921.
[29]冯晓庆，袁良杰，惠雅，等. E2对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤保护作用及G15的阻断效应[J]. 青岛大学学报（医学版）， 2018，54（1）：6-9.