【摘 要】
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本研究通过基因克隆技术以PRV弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源臂，以及绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒，然后将pBeloBACll
【机 构】
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中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001华中农业
【出 处】
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2010新型疫苗研发及基因工程疫苗应用研讨会
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本研究通过基因克隆技术以PRV弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源臂，以及绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒，然后将pBeloBACll线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BACII。将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞，利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记，经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC。通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生K特性进行研究，结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒BarthaK61株相比没有明显差别，说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度。重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代，绿色荧光蛋白仍能够稳定表达，通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列，表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传。本研究成功获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC，为进一步开展PRV的细菌人工染色体的构建奠定了基础。
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