论文部分内容阅读
目的新生血管(neovascularization,NV)形成作为许多眼病的重要并发症被广泛研究,越来越多的研究表明它与炎症和免疫细胞密切相关。本课题拟通过体内外研究探讨白细胞介素-17A(interleukine-17A,IL-17A)在眼NV形成中对巨噬细胞(macrophage,Mf)活化和极性转变,进而影响NV形成的作用和潜在机制。方法1.选择C57BL/6J小鼠分别建立氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型、激光诱导脉络膜NV形成模型(choroidal neovascularization,CNV),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)高表达rho/VEGF转基因小鼠模型。分别行玻璃体腔注射予IL-17A中和抗体或重组IL-17A蛋白及PBS进行干预,全视网膜、脉络膜铺片免疫荧光染色比较各组与同模型同龄对照组眼NV形成情况。2.选择7日龄C57BL/6J野生型鼠和IL-17A基因敲除鼠随机分为正常对照组、OIR模型组,采用realtime RT-PCR法检测比较NV形成中不同时点Mf极化相关炎症因子表达;采用磁珠分离视网膜CD11b阳性细胞,流式细胞术检测不同时点视网膜M1和M2型细胞比例。3.体外培养RAW264.7小鼠Mf细胞系,予不同浓度(0、10、50、100ng/ml)IL-17A重组蛋白干预24小时,采用western blot法检测细胞MAPK各活性亚基、AKT蛋白磷酸化状态及Notch1蛋白的表达;realtime RT-PCR法检测Mf极化相关基因mRNA表达;采用多因子检测试剂盒检测培养上清中相关炎症因子表达;采用Griess反应法检测培养上清中一氧化氮(nitricmonoxide,NO)浓度。4.体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),分别予不同浓度(0、10、50、100ng/ml)IL-17A重组蛋白或该蛋白干预RAW264.7细胞后的培养上清干预,采用CCK-8法检测不同时间后HUVECs增殖情况,realtime RT-PCR检测VEGFR1及VEGFR2 mRNA表达;采用Matrigel基质胶检测HUVECs管形成情况。结果IL-17A中和后的各模型小鼠视网膜或脉络膜NV较同龄对照组显著减少。IL-17A基因敲除鼠相较于野生型对照组M1相关细胞因子表达显著下降,并显示出M2极化比例增高。体外实验研究显示IL-17A干预促进Mf向M1极化,同时促炎及促血管生成因子表达显著升高。经IL-17A干预的Mf培养上清能促进体外HUVECs细胞增殖、管腔形成,同时VEGFR1和VEGFR2基因表达显著上调。结论中和IL-17A能通过促进Mf向M2极化并减少M1细胞VEGF表达,进而减轻眼NV形成,提示IL-17A的促NV作用可能通过调控Mf功能间接发挥。