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目的:胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤。尽管存在手术、放疗及化疗等多种治疗方式,恶性胶质瘤患者平均生存期不超过15个月。胶质瘤在组织中以血管新生和血管形成为主要特征,但是包括贝伐珠单抗的抗血管生成的靶向药物对胶质瘤治疗效果并不满意。血管生成拟态是在1999年被发现一种不依赖血管的肿瘤供血形式。对胶质瘤血管生成拟态分子的研究,有望成为胶质瘤血管治疗的新方向。RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)是一类能与RNA特异性结合成核糖核蛋白(RNPs),并通过调节转录、编辑、可变剪切、聚腺苷酸化、易位、转换等方式调节RNA功能,有望成为肿瘤治疗重要靶点。ZRANB2是一种RNA结合蛋白,最初在大鼠球旁细胞中被鉴定。ZRANB2在HEK293T细胞中可以通过与Smad蛋白结合抑制BMP信号通路。研究发现,ZRANB2在卵巢癌中高表达,但是尚未见ZRANB2在胶质瘤组织和细胞中表达并参与调节血管生成拟态的研究报道。最近研究表明,lnc RNAs在表观遗传调控、转录调控、转录后调控、翻译调控等方面调节基因表达,对胶质瘤的诊断和治疗有重要意义。SNHG20最初在肝细胞癌中被鉴定,在肝细胞癌中高表达,促进肝细胞癌增殖和迁移能力,并与患者预后成负相关。目前尚未见SNHG20调节胶质瘤发病机制相关报道。Staufen1(STAU1)介导的m RNA衰变(STAU1-mediated m RNA decay,SMD)途径是哺乳动物细胞中lnc RNAs降解m RNA的方式之一。lnc RNAs的Alu元件可通过与靶基因的Alu元件的特异性结合,形成STAU1结合位点(SBS),促使靶基因的m RNA与移码增加蛋白1(UPF1)结合,特异性降解靶基因m RNA。转录因子FOXK1(Forkhead box K1,FOXK1)叉头框家族蛋白中的一个重要成员。研究表明,FOXK1在不同肿瘤中表达水平不同,发挥的作用也不相同。在结直肠癌中FOXK1高表达,FOXK1和FOXK2将DVL(Dishevelled)相关蛋白转移至细胞核内,正向调节Wnt/β-catenin信号通路,从而促进肿瘤细胞增殖。但在乳腺癌中FOXK1低表达,其表达量的增高与乳腺癌的预后呈正相关。目前,尚未见FOXK1调节胶质瘤血管生成拟态的研究报道。基质金属蛋白酶1(MMP1)与基质金属蛋白酶9(MMP9)同属于降解细胞外基质的金属蛋白酶家族,目前已被证明MMP1、MMP9分别与肾透明细胞癌及卵巢癌血管生成拟态相关,抑制MMP1及MMP9可以减少肾透明细胞癌和卵巢癌血管拟态的形成。内皮特异性血管内皮钙粘蛋白(VE-Cadherin)已被证实在胶质瘤中高表达,并与肿瘤恶性级别相关,且可促进胶质瘤血管生成拟态。转录因子FOXK1调控MMP1、MMP9和VE-Cadherin的转录进而调节胶质瘤血管生成拟态,目前尚未见报道。本研究首先检测胶质瘤组织及U87和U251胶质瘤细胞中ZRANB2、SNHG20和FOXK1的表达,研究ZRANB2、SNHG20和FOXK1对胶质瘤血管生成拟态的作用;进一步研究ZRANB2、SNHG20、FOXK1之间在调节胶质瘤血管拟态的中的可能作用机制。本研究旨在为胶质瘤发生发展的机制研究提供新的理论和实验依据,也为胶质瘤的治疗提供新靶点。研究方法:1、Real-time PCR检测目的ZRANB2、SNHG20及FOXK1表达水平;2、Western blot检测ZRANB2、FOXK1、MMP1、MMP9及VE-Cadherin表达水平;3、胶质瘤细胞稳定转染ZRANB2沉默与过表达质粒、SNHG20沉默与过表达质粒、FOXK1沉默与过表达质粒、STAU1沉默质粒、UPF1沉默质粒;3.Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力;4、CCK-8实验检测细胞增殖能力;5、体外管形成实验检测细胞血管拟态生成能力;6、双荧光素酶报告基因系统验证SNHG20和FOXK1 m RNA通过Alu序列存在靶向结合作用;7、RNA结合蛋白免疫沉淀法实验验证ZRANB2与SNHG20、SNHG20与STAU1、FOXK1 m RNA与STAU1存在结合作用;8、染色质免疫共沉淀实验验证FOXK1与MMP1、MMP9及VE-Cadherin启动子区存在结合作用;9、RNA新生实验检测SNHG20及FOXK1 m RNA新生RNA;10、半衰期实验检测SNHG20及FOXK1 m RNA的RNA半衰期;11、CD34-PAS免疫组化染色检测组织血管生成拟态;12、裸鼠移植瘤实验检测肿瘤成瘤能力及血管拟态生成能力。结果:1.ZRANB2在胶质瘤组织及细胞中高表达,沉默ZRANB2显著抑制MMP1、MMP9及VE-Cadherin的表达,抑制胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成。过表达ZRANB2显著增强MMP1、MMP9及VE-Cadherin的表达,增强胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成。2.SNHG20在胶质瘤组织及细胞中高表达,在胶质瘤细胞沉默ZRANB2的表达,显著降低了SNHG20的表达。在胶质瘤细胞过表达ZRANB2,能显著增强SNHG20的表达。沉默SNHG20显著抑制MMP1、MMP9及VE-Cadherin的表达,抑制胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成。过表达SNHG20显著增强MMP1、MMP9及VE-Cadherin的表达,增强胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成。3.RNA-IP验证ZRANB2与SNHG20存在结合作用。过表达ZRANB2能延长SNHG20半衰期,沉默ZRANB2能缩短SNHG20半衰期。沉默ZRANB2同时沉默SNHG20能显著抑制MMP1、MMP9及VE-Cadherin的表达,抑制胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成。过表达ZRANB2同时过表达SNHG20能显著增强MMP1、MMP9及VE-Cadherin的表达,增强胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成。4.FOXK1在胶质瘤组织及细胞中低表达,沉默ZRANB2或者沉默SNHG20显著升高FOXK1的表达,过表达ZRANB2或者过表达SNHG20显著降低FOXK1的表达。沉默STAU1或者沉默UPF1能增强FOXK1表达。过表达FOXK1显著降低MMP1、MMP9及VE-Cadherin的表达,抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭及血管拟态的形成能力。沉默FOXK1能显著增强MMP1、MMP9及VE-Cadherin的表达,增强胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭及血管拟态的形成能力。5.双荧光素酶实验验证了SNHG20与FOXK1 m RNA通过Alu序列存在靶向结合作用。RNA-IP实验验证了SNHG20、FOXK1 m RNA与STAU1存在结合作用。沉默SNHG20显著延长FOXK1m RNA半衰期,过表达SNHG20显著缩短FOXK1 m RNA半衰期。沉默STAU1或者沉默UPF1显著延长FOXK1 m RNA半衰期。沉默SNHG20同时过表达FOXK1显著抑制MMP1、MMP9及VE-Cadherin的表达,抑制胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成。过表达SNHG20同时沉默FOXK1显著增强MMP1、MMP9及VE-Cadherin的表达,增强胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及血管生成拟态的形成。6.FOXK1与MMP1、MMP9及VE-Cadherin启动子区结合,抑制转录。7.沉默ZRANB2联合应用沉默SNHG20显著抑制裸鼠移植瘤生长,延长其生存期,并且减少胶质瘤血管生成拟态的形成。结论:1.ZRANB2和SNHG20在胶质瘤组织及U87和U251胶质瘤细胞中高表达,沉默ZRANB2或SNHG20能够抑制胶质瘤细胞血管生成拟态的形成。FOXK1在胶质瘤组织及细胞中低表达,过表达FOXK1能够抑制胶质瘤细胞血管生成拟态的形成。2.ZRANB2与SNHG20存在特异性结合作用,ZRANB2能够增加SNHG20的稳定性。3.SNHG20通过SMD途径作用于FOXK1,SNHG20增加FOXK1的m RNA降解。4.FOXK1通过与MMP1、MMP9及VE-Cadherin的启动子结合,抑制其转录,从而抑制胶质瘤细胞血管生成拟态的形成。5.沉默ZRANB2能够通过降低SNHG20的稳定性,降低其表达;减弱SNHG20对FOXK1的m RNA降解作用,增加FOXK1的表达;进而抑制MMP1、MMP9及VE-Cadherin转录,从而抑制胶质瘤细胞血管生成拟态的形成。