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研究背景经皮血管腔内成形术(Percutaneous transluminal angioplasty,PTA)是临床治疗心血管疾病最常用的手段之一,在临床中挽救了很多冠心病、颈动脉狭窄、下肢动脉硬化闭塞症的患者,但是PTA的主要缺点是术后易出现血管弹性回缩和内膜增生造成血管再狭窄(re-stenosis,RS),严重影响患者的远期疗效和生存质量。刺芒柄花素(Formononetin,FMN)是鸡血藤等很多中药材的主要活性成分之一,且在2010版中国药典中被作为鸡血藤的定性指标,其药理活性包括抗肿瘤,清除氧自由基,减少细胞脂质过氧化物,降低胆固醇等。据文献报道,鸡血藤的主要成分刺芒柄花素可能具有抗血小板血小板聚集、抑制血栓血栓形成和抑制内膜增生的作用。在此研究中,我们旨在研究鸡血藤中刺芒柄花素等主要成分的测定及在大鼠体内的药物代谢动力学情况,并研究刺芒柄花素对大鼠颈动脉球囊损伤模型中颈动脉损伤的作用及对血小板聚集作用,同时研究了体内外对颈动脉球囊损伤引起的新生血管内膜形成及PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖和迁移能力的影响,并进一步研究了其潜在的作用机制。试验方法第一部分UPLC-MS/MS同时测定大鼠血清中鸡血藤提取物中刺芒柄花素等四种黄酮类化合物方法的建立及药代动力学研究采用临床常用水煎方法,并脱水浓缩制备冻干鸡血藤提取物。鸡血藤水煎3小时,滤液脱水后制成冻干CSE;标准和质量控制样本的准备,混合母液是含有浓缩的原儿茶酸、儿茶酸、没食子儿茶素0.5mg/ml,刺芒柄花素0.8mg/ml的甲醇溶液,按(1:1:1:1,v/v/v/v)进行混合。内标准(芫花素)母液在甲醇为0.5mg/ml。标本准备,采用乙酸乙酯液液萃取法处理血浆样品,选择芫花素作为内标准,利用超高效液相色谱联合质谱分析(Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法建立血浆样品中原儿茶酸、儿茶酸、没食子儿茶素、刺芒柄花素的分析方法。验证过程:色谱条件和质谱条件优化,选择性和线性范围,精密度和准确度实验,基质效应和提取回收率及稳定性试验。选择SD大鼠作为实验对象,灌胃给予鸡血藤剂量0.638g/kg(等量于0.64mg/kg原儿茶酸,6.73mg/kg儿茶酸,5.17mg/kg没食子儿茶素,1.06mg/kg刺芒柄花素)。鸡血藤提取物灌胃之前和之后的9个时间点分别采取大鼠眶下静脉收集血液样品于肝素化试管中,离心后,储存于-80℃。运用DAS 2.1套装程序,以非室模型分析血药浓度VS时间数据计算出药物代谢动力学参数。第二部分刺芒柄花素在大鼠颈动脉球囊损伤模型中对血管内膜增生和血小板聚集作用研究构建大鼠颈动脉球囊损伤模型,90只大鼠随机分为分为6组,每组15只,分组情况如下:假手术组,模型组,模型给予低中高三个剂量刺芒柄花素组(刺芒柄花素低剂量组25 mg/Kg,刺芒柄花素中剂量组50 mg/kg,刺芒柄花素高剂量组100 mg/kg),阿司匹林对照组(10 mg/kg)。手术后第二天起开始给药,持续给药2周。Born比浊法测定血小板聚集率;硝酸还原酶法检测血清一氧化氮(nitric oxide,NO)水平,放射免疫法检测血清中内皮素-1(endothelin l,ET-1)、血栓素A2(Thromboxane A2,TXA2)水平,ELISA检测血清中血小板衍生因子(Platelet derived growth factor,PDGF)、前列环素(Epoprostenol,PGI2)水平;HE观察颈动脉病理变化。第三部分刺芒柄花素对大鼠颈动脉球囊损伤导致的内膜增生及血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响和机制研究建立大鼠颈动脉球囊损伤模型用于评价刺芒柄花素抑制血管损伤导致的内膜增生的作用。H&E染色进行颈动脉病理学观察。分离培养原代大鼠动脉血管平滑肌细胞SMCs,CCK-8和Transwell实验检测刺芒柄花素对PDGF-BB诱导的SMCs细胞增殖和迁移的作用。免疫组化和免疫细胞化学法分别检测各组动脉组织和原代培养的SMCs细胞中转化生长因子a(Transforming growth factor-a,TGF-a)表达水平。Smad3/p-Smad3表达通过western blotting实验进行分析。实验结果1.UPLC-MS/MS同时测定大鼠血清中鸡血藤提取物中刺芒柄花素等四种黄酮类化合物方法的建立及药代动力学研究UPLC-MS/MS同时测定大鼠血清中鸡血藤四种黄酮类化合物方法的建立及药代动力学数据。在优化色谱分析及质谱分析中,对于阳性和阴性电离模式同时被优化。分析物和内标准的电离,相对给予负离子模式比阳离子模式更多的强烈反应。通过优化,对于所有化合物的测试,0.05%甲酸可以增强离子化的效应,获取得更多比纯蒸馏水。为了获取满意的敏感度和好的峰值形态,我们选取0.05%甲酸和甲醇(35:65,v/v)作为等度洗脱液。原儿茶酸、儿茶酸、没食子儿茶素、刺芒柄花素和内标准的保留时间分别为:1.1,1.1,1.1,2.2和4min。应用乙酸乙酯进行液液萃取最终确定下来,简单和可重复提取并有很好的回收率。在0.5-200ng/ml范围对于原儿茶酸、儿茶酸、没食子儿茶素和0.8-320ng/ml范围刺芒柄花素呈线性。校准曲线的系数(r)对所有的校正曲线>0.99。最低量化下限(LLOQ)定义为信噪比>10,准确度和精确度在±20%范围内。药物代谢动力学研究结果显示AUC0-t价值对于儿茶酸和没食子儿茶素分别为67.52±9.47和63.64±19.37μg h/l。儿茶酸和没食子儿茶素(6.73mg/kg儿茶酸和5.17mg/kg没食子儿茶素)在相同剂量水平时显示有相似的口服吸收率,结果是因为它们具有相似的化学结构。同时也观察到口服没食子儿茶素浓度比刺芒柄花素高5倍时在血清浓度-时间曲线中AUC0-t价值是相似的,表明大鼠对于刺芒柄花素的吸收明显大于没食子儿茶素。本研究结果对于研究鸡血藤提取物的主要成分的作用机制具有重要意义,同时对于中药的药物代谢动力学的研究也提供了有效的工具。2.刺芒柄花素在大鼠颈动脉球囊损伤模型抑制抗血小板聚集和血管内膜增生刺芒柄花素给药显著改善大鼠颈动脉球囊损伤模型中颈动脉血管组织病理学结构改变,缓解内膜增生。与模型组相比,刺芒柄花素显著抑制了血小板聚集,使其PAGmax、IR显著降低,且与模型组存在显著性差异(p<0.05)。与模型组相比,刺芒柄花素剂量组NO、PGI2水平显著升高,且存在显著性差异(p<0.05)。各给药组血清ET-1、TXA2、PDGF水平显著降低,且存在显著性差异(p<0.05)。3.刺芒柄花素通过调节TGF-al/Smad3信号通路抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移保护大鼠颈动脉球囊损伤导致的内膜增生刺芒柄花素显著改善大鼠颈动脉球囊损伤模型血管内膜增生,新生内膜中的平滑肌细胞较模型组明显减少,内皮较完整光滑,内膜增生较轻,抑制新生内膜平滑肌细胞增殖,血管结构变化与模型组相比明显得到改善。刺芒柄花素处理能够抑制PDGF-BB诱导的体外SMCs细胞增殖(p<0.05),降低Transwell迁移试验中穿过小室的细胞数和划痕实验中细胞迁移率(p<0.05)。体内外实验均发现刺芒柄花素能够降低血管平滑肌细胞TGF-a表达水平,并且Smad3表达也能被刺芒柄花素显著抑制。结论1.UPLC-MS/MS测定大鼠血清中鸡血藤四种黄酮类物质的含量,刺芒柄花素大鼠体内吸收率最高,推测刺芒柄花素是鸡血藤抗血小板聚集、抑制内膜增生的主要活性成分。2.刺芒柄花素各剂量组能改善大鼠颈动脉球囊损伤模型血管内膜增生,可显著抑制ADP,胶原、AA诱血小板聚集现象,显著提高血清中NO含量、明显降低ET-1、PDGF水平,纠正TXA2/PGI2失衡,从而达到抗血小板聚集、抑制内膜增生作用。3.体内外实验均证明刺芒柄花素能够显著改善大鼠颈动脉球囊损伤,具体作用机制可能与抑制平滑肌细胞增殖和迁移,调节TGF-al/Smad3信号通路有关,从而缓解球囊损伤诱导的内膜增生。