规模化养猪业的迅速发展为丰富居民菜篮子工程作出了重大贡献，同时规模化养猪场粪便的大量集中排放给环境造成了巨大压力。堆肥技术起源较早，通常用于有机固体废弃物的资源化利用，是实现养猪业与环境协调发展的有效途径之一。堆肥的实质是微生物的代谢作用。而且，堆肥微生物多样性的研究是近年来的热点。研究表明，当前采用的强制通风好氧堆肥系统会导致物料中存在“梯度效应”，但是其产生的微生物学机理还不得而知。由于温度是控制微生物群落结构组成的关键因素之一，因此，在“梯度效应”存在的情况下微生物的空间分布应具有异质性。因而，本研究应用16SrRNA基因作为分子标记，对猪粪堆肥过程中升温期、高温期和降温期的上、中、下三层共9个堆肥样品中的细菌群落组成及多样性进行了深入研究，并采用变性梯度凝胶技术对9个堆肥样品的细菌区系变化进行了检测。具体结果如下：1．堆肥试验　　 利用强制通风静态仓堆肥系统进行了猪场废弃物堆肥试验，物料碳氮比调整为20，起始含水率为65％，堆肥过程历经快速升温期、持续高温期和降温期三个典型阶段，堆制结束时，堆体体积减少了41.67%。堆体温度在40h达到50℃，并在60℃以上维持10d，蛔虫卵杀灭率和大肠杆菌值分别为100%和0.062，达到国家粪便无害化卫生标准的必要条件。整个堆肥过程历时53d。堆肥试验取得成功，为后续研究工作奠定了基础。2．核酸的提取　　 参照Holben(1994)提供的改良方法，对堆肥过程中升温期、高温期和降温期上、中、下三层共9个堆肥样品进行了微生物的分离、细胞破碎和基因组DNA的提取。琼脂糖凝胶电泳检测片断大小在15Kb以上。采用DNA/RNA浓度测定仪，测得的A260/A280的比值在1.6-1.8之间，浓度为350ng/μL左右。结果表明，采用本方法提取、纯化获得的核酸结果较好，能够满足后面的PCR、克隆等分子生物学研究的需要。　　 3．基于16SrRNA分子标记的分子生物学分析　　 (1)将测序结果运用Clustalw程序进行序列比对，堆肥升温期的上、中、下三层分别被分为33、56和32个序列型；高温期的上、中、下三层分别被分为48、46和44个序列型；降温期的上、中、下三层分别被分为48、26和35个序列型。　　 (2)温度是影响堆肥微生物群落结构组成的关键因素之一。　　 (3)整个堆肥过程中，在有效分析的1158个克隆子中，总共有357个序列型，约87.4%的序列型归到Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria(包括α-Proteobacteria、B-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和δ-Proteobacteria)、Actinobacteria这4个类群中，相应克隆子所占的比例分别是70.6%、1.47%、15.11%、3.80%。另外占全部克隆子数约9%的44个序列型则和Genbank数据库中的纯培养菌无任何相似性。　　 (4)堆肥初期Shigella、Clostridium等占优势；高温期Bacillus、Clostridium、Ureibacillus thermosphaericus等占优势；降温期Thermobifida fusca、Clostridium等占优势；而在整个堆肥化过程中Clostr idium都是优势菌属。　　 (5)发现了44条未培养菌的序列，与已知菌的序列无任何相似性，但和GenBank中的已知序列有高度相似性。而这些新的序列或可能是新的物种，它们在堆肥过程中究竟起到什么作用，都是值得我们进一步研究的问题，它们在不久的将来很可能成为人类可开发和可利用的堆肥微生物资源。我们所获得的这些新序列填补了国内这方面的不足，为相关领域的研究者提供了宝贵的科研资料。　　 (6)获得了368条堆肥微生物的16S rDNA序列，并提交到了欧洲核酸序列数据库（European Molecular Biology Laboratory, EMBL），获得登陆号：AM182993-AM183113, AM500715-AM500852, AM930270-AM930378。4．PCR-DGGE分析　　 (1)PCR-DGGE分析结果显示，猪场废弃物堆肥过程中不同时期、不同高度层样品中有着比较丰富的细菌多样性，同时存在明显的优势种群结构变化。PCR-DGGE图谱中主要的优势性条带都达到或接近10条以上，加上微弱的条带会更多，表明猪场废弃物堆肥过程中如此丰富的微生物是潜在的宝贵资源。　　 (2)通过Cs值分析结果显示，整个降温期3个样品之间的相似性相对更高些，说明降温期3层样品的微生物组成更接近；样品1和9、3和6、6和9的Cs值相对较低，说明在堆肥的不同时期，不同高度层存在明显的细菌群落动态变化；9个样品之间的Cs值没有明显的变化规律，说明堆肥过程伴随着复杂的微生物演替，且更替过程很复杂，需要我们进行更为深入的研究。　　 在堆肥的不同时期不同高度层堆肥微生物表现出了丰富的多样性，直接为我们提供了“梯度效应”存在的生物学证据，为诠释和控制“梯度效应”提供了理论依据。