石斑鱼是一种富含多种矿物质元素和维生素,深受消费者喜爱的海水食用鱼,也是我国东南沿海(福建、广东、海南)等地区重要水产养殖鱼类。近年来,在人工养殖石斑鱼过程中深受虹彩病毒病、肠炎、寄生虫病等多种疾病困扰,其中尤以病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis,VNN)最为严重,该病在损害养殖户利益的同时也极大阻碍了我国水产养殖业的发展。VNN主要爆发于海水鱼类的育苗期间即幼鱼期和稚鱼期,是由病原神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)入侵鱼体,导致患病鱼行为异常,运动失衡,厌食绝食,最终死亡的一种大危害性、高发生率的病毒性疾病。距今为止,尚未发现有特效药物、有效疫苗或比较好的防治手段去预防或治疗该病,故到目前为止石斑鱼的养殖工作仍然受到很大的阻碍。因此本研究利用转基因微藻混合海水鱼饲料,投喂石斑鱼使其从幼苗阶段就开始获得持续性抗原免疫,来预防病毒性神经坏死病。本研究已从以下方面进行:生物饵料的筛选、纯化、保种、大规模培养;使用电击转化法将pMaa7IR/DGNNVIR表达载体转化入小球藻中,经筛选、DNA鉴定后选出转基因小球藻。先利用转基因小球藻配合海水鱼饲料制作混合饲料投喂石斑鱼,而后进行攻毒实验,并对其预防效果进行评价。研究结果如下:1、采用平板划线法将小球藻保存于固体TAP培养基,并通过逐级扩大培养法进行扩大培养。使用封闭式光生物反应器养殖小球藻,共获得纯净无污染的小球藻液1500L,将生产得到的小球藻用于石斑鱼混合饲料的制作。2、培养纯净无污染的轮虫作为石斑鱼养殖中的生物饵料,从养殖用水盐度、pH、饵料投喂量方面确定了“S”型褶皱臂尾轮虫养殖条件。经本研究结果显示养殖用水盐度20～30时,轮虫种群密度、日平均增殖率达到最大。盐度10～20时,种群密度随盐度升高而增加,当盐度低于10,随盐度降低轮虫增殖效率逐渐下降,盐度低于5轮虫彻底死亡;当pH在7.5～8.5范围时,种群密度、日平均增殖率达到最大值;在盐度、pH、温度等条件适宜情况下,本实验所设置的各个投喂量梯度中维持轮虫培养液中小球藻密度在5×106个/mL以上获得最大种群密度,故得出结论投喂间隔越短、投喂量越大,轮虫种群增长速率越快,最终可以达到的种群密度也会略有上升。3、使用电击转化法将pMaa7IR/DGNNVIR重组载体转入小球藻中,电击条件为:转化电压800V～1600V,脉冲长度032μs,脉冲间隔200ms,脉冲次数90次,电击2～3次;使用10μg/mL巴龙霉素固体TAP培养基进行筛选,并对已筛选过的小球藻进行DNA鉴定,最终获得8株转基因小球藻,对转基因小球藻进行扩大培养,共获得1500L转基因小球藻液。4、将采收的小球藻藻液离心,刮取藻泥,按藻泥:饲料(1:1)比例制作混合饲料,最终制得950g的混合饲料颗粒。使用混合饲料连续投喂石斑鱼,饲养10天后进行攻毒实验。将已经确定病毒拷贝数的病毒提取液(24copies/μL),使用腹腔注射的方法进行攻毒。攻毒过后从分子水平、细胞学水平、生物学水平进行效果评价。结果显示在攻毒48h后实验组石斑鱼眼、脑组织内病毒含量相比于对照组石斑鱼分别降低了 51.70%、48.47%、53.02%;攻毒48h后取石斑鱼眼、脑组织,制作组织切片可清晰看到鱼眼视网膜、脑组织开始出现空泡化病理变化;攻毒后第2、4、6、10、14天对各组石斑鱼取样测定石斑鱼体内神经坏死病毒拷贝数,结果表明,实验组石斑鱼体内病毒增长趋势、病毒拷贝数要低于对照组;攻毒14天后统计最终成活率。最终成活率:DGNNVRNAi1混合饲料组相较于对照组提高了 26.0%,DGNNVRNAi2混合饲料组相较于对照组提高了 22.0%,DGNNVRNAi3混合饲料组相较于对照组提高了 26.0%。综上所述,经实验结果分析表明转pMaa7IR/DGNNVIR基因小球藻在预防石斑鱼神经坏死病方面有一定作用,可以有效地抑制病毒在石斑鱼体内增殖。