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目的:研究片仔癀干预对肝癌细胞生长的影响及调控机制;建立肝癌干细胞富集体系,筛选肝癌干细胞差异表达miRNA;从肝癌干细胞miRNA调控进一步明确片仔癀对肝癌干细胞生长的干预作用和调控机制。方法:1、培养肝癌HepG2和BEL-7402细胞,并给予不同浓度的片仔癀(0-0.75 mg/mL)干预,通过倒置显微镜观察细胞形态和密度,采用MTT实验检测细胞活力,应用集落形成实验检测细胞存活能力,通过PI染色和流式细胞仪检测细胞周期改变,通过Hoechst染色观察细胞凋亡情况,采用Western-blot检测片仔癀干预对肝癌细胞Bax、Bcl-2、CyclinD1、CDK4、OCT4 和 SOX2 的影响。2、分别在完全培养基常规培养和无血清肿瘤干细胞培养基悬浮培养条件下培养HepG2细胞,采用倒置显微镜观察克隆球和亲本细胞生长情况,通过RT-PCR检测OCT4表达和流式细胞仪检测CD133、CD90阳性细胞比例,进一步采用miRNA芯片筛选克隆球和亲本细胞miRNA差异表达,并通过Q-PCR实验对差异表达进行验证。3、采用无血清肿瘤干细胞培养基悬浮培养HepG2细胞富集肝癌干细胞,并给予片仔癀干预,通过台盼蓝染色计数检测细胞生长情况,通过PI染色和流式细胞仪检测细胞周期改变,通过Hoechst染色观察细胞凋亡情况;采用高内涵观察细胞克隆球形成能力改变,通过皮下移植瘤模型观察细胞体内致瘤能力变化;采用Western-blot检测Bax、Bcl-2、CyclinD1、CDK4、SOX2、OCT4、p21 的表达,通过 Q-PCR、Western-blot 检测miR-483-5p及其靶基因CDKN1A(p21)的表达。结果:1、不同浓度片仔癀干预HepG2和BEL-7402细胞后,显著抑制肝癌细胞生长和降低细胞活力,明显抑制细胞存活能力和阻滞细胞周期从G0/G1到S期的转换的过程,显著诱导细胞凋亡;显著降低Bcl-2/Bax比例,下调细胞周期调控蛋白CyclinD1、CDK4的表达;明显下调肝癌干细胞标志物OCT4和SOX2的表达。2、采用无血清肿瘤干细胞培养基悬浮培养HepG2细胞,成功获得HepG2克隆球细胞,且所获得的克隆球细胞高表达干性基因OCT4,干细胞标记物CD133和CD90双阳性细胞比例明显升高,证实了无血清肿瘤干细胞培养基悬浮培养具有富集肝癌干细胞的作用;miRNA芯片检测结果证实与亲本细胞相比,HegG2克隆球中有234个miRNA表达显著上调,有218个miRNA表达显著下调(cut off>1.5倍,P<0.05),其中miR-483-5p、miR-582-5p在HegG2克隆球中的表达显著上调(P<0.05),Q-PCR检测进一步验证了二者在HepG2克隆球表达上调的结果。3、片仔癀干预对HepG2克隆球细胞具有抑制生长和降低细胞活力的作用,具有抑制细胞从G0/G1期到S期转换的过程和诱导细胞凋亡的作用;能够显著抑制细胞体外克隆球形成能力和体内致瘤能力及生长的作用;片仔癀干预对HepG2克隆球细胞具有显著降低Bcl-2/Bax比例,下调细胞周期调控蛋白CyclinD1、CDK4的表达;明显下调肝癌干细胞标志物OCT4和SOX2的表达;此外可显著下调miR-483-5p的表达,同时上调其靶基因CDKN1A/p21在mRNA和蛋白水平的表达。结论:片仔癀通过调控细胞增殖凋亡相关调控因子Bcl-2/Bax比例、CyclinD1和CDK4的表达具有显著抑制肝癌细胞生长的作用,且具有下调干性基因SOX2和OCT4表达的作用;成功复制无血清肿瘤干细胞培养基悬浮培养富集肝癌干细胞体系,证实miR-483-5p、miR-582-5p等多个miRNA在肝癌干细胞中具有显著调控效应;片仔癀干预显著抑制肝癌干细胞生长和体内外致瘤能力,且通过调控细胞增殖、凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比例、CyclinD1、CDK4和miR-483-5p及其靶基因CDKN1A(p21)表达进而抑制肝癌干细胞生长和诱导细胞凋亡可能是其抑制肝癌细胞生长的重要机制之一。