一.研究背景骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndromes,MDS)是一组起源于造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)或多能干细胞(multipotent stem stem cell,MSC)的恶性克隆性疾病,其生物学特性常表现为髓系细胞(粒系、红系、巨核系)一系或多系发育异常、无效造血以及造血功能衰竭,并具有向急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)转化的高风险。MDS主要见于老年人群,流行病学显示50%～70%MDS患者的发病年龄在50岁以上,在我国的发病率约为10/10万～12/10万人口,且发病率随着年龄的增加而逐渐升高。近年来,随着我国老龄化人口的进程,MDS的发病率较前升高,但由于目前尚缺乏有效的临床治疗手段,使得MDS的缓解和治愈率并不高。MDS的发生发展机制至今尚未形成完整的理论。它是一个累及多阶段的病理过程,并具有高度的异质性。从MDS的临床研究得出的结论是:70%以上MDS患者存在细胞遗传学异常或基因突变。致病基因表达异常、基因突变、表观遗传学异常等分子生物学特性的改变参与了MDS的发生;信号转导通路和转录因子的异常、骨髓造血微环境改变、免疫机制缺陷等多方面因素共同推动了 MDS的发展。目前对于MDS发病的始动因素和各发展阶段的分子机制知之甚少,尤其是MDS向AML发生转化的相关分子机制。研究MDS发生发展的的分子生物学机制,对早期诊断MDS、评估患者向AML转变的风险并进行早期干预治疗、改善MDS患者的预后,都有着重要意义。微小RNA(microRNA,简称miRNA)是近年来引起广泛关注的一类内源性非编码RNA,长度约20～22个核苷酸。miRNA通过与靶基因的3’UTR区完全或不完全互补配对,降解靶基因mRNA或抑制其翻译表达来实现对靶基因表达水平的转录调控,由此可见,miRNA对基因表达起着重要的负调控作用。随着对miRNA研究的深入,研究者发现这一广泛存在于生物界各物种的小分子物质,对生物体的生长发育、细胞的增殖和凋亡、机体免疫调控等生理活动都具有重要作用。近年的研究结果提示:在一些疾病特别是肿瘤性疾病中,某些特异性miRNAs的表达与该疾病的发生发展及预后密切相关,并能作为该疾病的早期诊断和预后评估的指标。miRNAs能够调控造血干细胞定向分化潜能,在造血干细胞受损的疾病中发挥了重要的分子调控作用。目前在AML、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)以及淋巴瘤(lymphoma)等疾病中,有关特异性miRNAs表达的研究已取得了一定进展。MDS起源于造血干细胞或多能干细胞的异常克隆,随着疾病进展出现骨髓细胞增殖和凋亡的紊乱,基于miRNAs在造血干细胞恶性克隆性疾病中的地位,我们推测miRNAs在MDS的发生发展中也可能发挥着重要作用。目前关于miRNAs在MDS发病中的机制研究仍处于起步阶段,已有部分研究进行了 MDS患者与正常人之间差异表达的miRNAs的筛选,而关于MDS向AML转化患者中特异性表达的miRNAs的研究报道较少。所以,本课题拟通过对MDS患者,特别是高风险向AML转化的MDS患者中特异性表达的miRNAs的研究,找寻能预测MDS向AML转变的miRNAs,为MDS患者的早期诊断和干预治疗提供新的思路和理论依据。二.研究目的1.筛选MDS患者骨髓细胞特异性表达的miRNAs,寻找与MDS发生发展有密切关系的miRNAs。2.检测特异性miRNAs在MDS患者骨髓细胞中的表达量,并与MDS患者的临床特征进行相关分析,初步探讨特异性miRNAs与MDS发生发展的关系。预测特异性miRNAs的靶基因并检测其在MDS患者骨髓细胞中的表达量,分析特异性miRNAs与其靶基因表达量的相关性。3.通过改变MDS细胞株特异性miRNAs的表达水平,检测上调及下调miRNAs的表达水平对MDS细胞株增殖和凋亡的影响,初步探讨特异性miRNAs及其靶基因在MDS发生发展中的作用。最后通过双荧光素酶实验验证特异性miRNA的靶基因。三.研究方法1.利用microRNA芯片技术及分层聚类分析方法,对9例MDS患者和6例正常者骨髓细胞特异性表达的miRNAs进行筛选;采用Real-time PCR技术对部分特异性miRNAs(差异倍数在5倍以上,P<0.05)在12例MDS患者骨髓细胞的表达量进行检测,验证microRNA芯片的筛选结果。2.将样本量扩大到89例,包括54例MDS患者(低危组+中危-1组32例、中危-2组+高危组22例)、16例MDS转化白血病患者及19例正常对照者。结合文献选取芯片结果中部分特异性表达miRNAs,利用Real-time PCR技术检测其在各组样本中的表达量,分析特异性miRNAs的表达水平与MDS患者临床特征(年龄、性别、外周血血象、骨髓原始细胞比例、染色体异常情况等)的相关性。3.通过生物信息学技术、聚类分析方法,预测特异性miRNAs的靶基因。结合文献报道选取部分靶基因,利用Real-time PCR技术检测靶基因在MDS患者、MDS转化白血病患者骨髓细胞的表达量,并分析特异性miRNAs及其靶基因在MDS患者中表达量的相关性。4.采用人工合成的miRNA模拟物(miRNA mimics)及miRNA抑制剂(miRNA inhibitor)分别转染MDS-L细胞株(来源于MDS-RAEB患者),上调和下调miRNA的表达水平;使用Real-time PCR技术检测各组转染细胞miRNA靶基因的表达水平,分析miRNA与其靶基因表达量的相关性;通过MTS法和流式细胞术分别检测各组转染细胞的增殖和凋亡率,分析miRNA对MDS-L细胞增殖和凋亡的影响。5.构建miRNA-196b-5p的靶基因DICER1的表达载体,通过双荧光素酶报告基因实验,体外运用荧光报告系统检测过表达miRNA-196b-5p后对荧光素酶报告基因活性的影响。四、研究结果1.本课题利用microRNA芯片技术在9例MDS患者中检测出376个差异表达的microRNAs,通过分层聚类分析筛选出差异表达显著(差异倍数超过5倍以上,P<0.05)的miRNAs共19个,其中上调表达的miRNAs10个,下调表达的miRNAs9个;结合文献报道选取其中12个miRNAs,通过Real-time PCR技术在12例MDS患者中对其表达量进行检测。发现miR-196b-5p、miR-550a-5p等miRNAs在样本中表达量升高,与芯片筛选结果一致,并且miR-196b-5p在MDS中危-2组、高危组和转白组中表达明显上调(P<0.05)。2.通过扩大临床样本量,利用Real-time PCR技术对miR-196b-5p、miR-550a-5p在54例MDS患者、16例MDS转化白血病患者及正常者的表达量进行检测。发现miR-196b-5p在所有MDS患者骨髓中表达水平均升高,在低危+中危-1组中的表达水平是正常对照组的2.9倍(P=1.72×10-13)、在中危-2+高危组(不包括转白病例)中达到8.0倍(P=1.29×10-14),在MDS转白组中则达到了 11.4倍(P=1.38×10-16),随着MDS患者疾病危险度的增加,其miR-196b-5p表达水平逐步上升。3.分别将miR-196b-5p、miR-550a-5p的表达量与MDS患者的临床特征做相关分析后发现:染色体异常的MDS患者,其miR-196b-5p表达量明显高于染色体正常的患者(P<0.05);miR-196b-5p表达量较高的MDS患者中,最常见的染色体异常为复杂异常,其次为7号染色体异常,均为预后差核型;miR-196b-5p的表达量与患者骨髓原始细胞比值呈正相关(r=0.673,P<0.01);miR-550a-5p的表达量与MDS患者的临床特征之间无明显相关。4.运用生物信息学技术和聚类分析方法,预测出miR-196b-5p的靶基因共125个。结合文献报道,选取其中6个靶基因(ANXA1、DICER1、BIRC6、FAS及HOXC8),使用Real-time PCR技术分别检测这些靶基因在MDS患者骨髓中的表达,其中DICER1、ANXA1的表达水平随着miR-196b-5p表达量升高而降低(P<0.05),与miR-196b-5p表达量呈负相关关系(r值分别为-0.862与-0.508,P<0.05)。5.采用人工合成的miR-196b-5p mimics和miR-196b-5p inhibitor瞬时转染MDS-L细胞株,发现上调miR-196b-5p的表达后细胞的增殖明显增加、凋亡减少(P<0.05);而下调miR-196b-5p表达则出现细胞增殖减少、凋亡增加(P<0.05)。经双荧光素酶实验验证,miR-196-5p与靶基因DICER1的3’UTR结合,能抑制其表达,DICER1是miR-196-5p的靶基因。五、结论本课题的研究结果表明,在MDS患者骨髓细胞中存在特异性表达的miRNAs;根据IPSS评分标准,MDS患者不同危险组以及MDS转白患者之间也存在特异性表达差异的miRNAs;其中miR-196b-5p的高表达影响了MDS-L细胞株的增殖和凋亡,可能是通过调控其靶基因DICER1来发挥作用。由此我们推论,miR-196b-5p有可能成为预测MDS危险度的新的生物学指标,本课题对完善MDS发生发展的机制具有重要的理论意义,为临床早期干预及寻找新的治疗靶点提供了科学依据。