甘遂为大戟科大戟属植物甘遂Euphorbia Kansui T.N.Liou ex T.P.Wang的块根,始载于《神农本草经》,列为下品。其性苦寒,有毒,其功用为泻水逐饮、消肿散结,用于水肿胀满、胸腹积水、气逆咳喘、痰饮积聚、风痰癫痫、二便不利、臃肿疮毒等症。临床上广泛用于治疗肝硬化腹水、肾炎水肿、渗透性胸膜炎以及晚期血吸虫病所致的腹水等。但是,甘遂对口腔、胃肠道、眼及皮肤粘膜等具有严重的刺激性,并有致炎、促发肿瘤等毒性,有文献报道,甘遂有近似巴豆酸和斑蝥素的作用,对胃肠道粘膜有强烈的刺激作用,上述毒性严重制约着该药的临床使用。中医临床常用醋炙来降低甘遂的毒性和刺激性,但对于醋炙降低甘遂毒性作用的物质基础及作用机制,国内外迄今尚未见明确报道。因此本论文对醋炙降低甘遂胃肠道毒性机制进行了较为系统的研究,旨在为进一步揭示醋炙降低甘遂毒性提供依据。论文研究内容主要包括以下几部分:一、文献研究通过查阅相关古今文献,从胃肠道毒性的作用机理、常见具有胃肠道毒性的中药、降低中药胃肠道毒性的方法等方面对中药胃肠道毒性研究进行了较为系统的综述,为本论文制定切实可行的研究方案,确定研究考察指标及研究起点奠定了基础。二、通过体外筛选确定了甘遂胃肠道毒性部位以人正常胃上皮细胞株GES-1和大鼠小肠隐窝上皮细胞株IEC-6为研究对象,采用MTT法比较甘遂醇提物、甘遂乙酸乙酯部位、甘遂乙酸乙酯萃取后残渣、醋甘遂乙酸乙酯部位对GES-1细胞和IEC-6细胞的增殖抑制作用。结果显示,甘遂各提取物均具有胃、肠细胞毒性,其毒性大小顺序为甘遂乙酸乙酯部位>甘遂醇提物>甘遂乙酸乙酯萃取后残渣,而与甘遂乙酸乙酯部位比较,醋甘遂乙酸乙酯部位毒性降低(P<0.05,P<0.0I)。从而明确了甘遂胃肠道毒性部位为乙酸乙酯部位,且醋炙能够降低甘遂乙酸乙酯部位的毒性。三、甘遂胃肠道毒性部位的化学成分研究利用硅胶柱色谱、制备型高效液相色谱以及制备薄层色谱等分离手段,从甘遂胃肠道毒性部位中共分离得到了 11个化合物,通过化学方法和核磁共振数据分析,鉴定了 10个,其中巨大戟烷型二萜类4个,分别为:20-O-(2’E,4’Z-癸二烯酰基)巨大戟二萜醇(EK-0I),3-O-(2’E、4’Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇(EK-02),3-O-(2’E,4’E-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇(EK-03),5-O-苯甲酰基-20-去氧巨大戟二萜醇(EK-04);假白榄烷型二萜类1个,即kansuinine B(EK-05);三萜类化合物4个:Kansenonol(EK-06),Epi-kansenone(EK-07),ll-oxo-kansenonol(EK-08),大戟醇(EK-09);另外还有β-谷甾醇(EK-10)。四、考察了甘遂胃肠道毒性部位的化学成分对肠上皮细胞毒性。采用MTT法评价了甘遂胃肠道毒性部位的化学成分对肠上皮细胞株IEC-6的毒性,并探讨了可能的构效关系,结果表明,巨大戟烷型二萜类化合物的细胞毒性较大,且具有3位不饱和脂肪长链的化合物的毒性较强,同时,20位含氧基团的存在对其毒性亦有影响,如EK-01具有20位癸二烯酸酯基毒性较强。三萜类化合物中,7位具有羰基的EK-06,EK-07和EK-08均具有较强的细胞毒性,而7位不含羰基的EK-09的细胞毒性较低。假白榄烷型二萜类化合物未表现出明显的肠上皮细胞毒性。五、考察了醋炙降低甘遂致小鼠的胃肠道毒性及机制。1.正常小鼠灌胃给予甘遂和醋甘遂不同剂量的乙酸乙酯提取物,结果表明,与空白对照组比较,甘遂组各剂量组能明显改变胃、肠组织病理形态(P<0.05,P<0.01);与甘遂组比较,醋甘遂各剂量组能明显改善胃、肠组织病理形态(P<0.05,P<0.01)。透射电镜检查甘遂组小鼠胃固有腺体上皮排列紊乱,细胞质电子密度不均匀,细胞核形态不规则,醋甘遂组小鼠胃固有形态上皮细胞排列紊乱,个别细胞凋亡;甘遂组小鼠肠粘膜表面微绒毛数量减少、高度变矮,细胞间近表面的紧密连接较短,醋甘遂组小鼠肠上皮细胞排列规则,细胞形态一致,表面微绒毛数量减少、高度变矮,但较规则。提示,甘遂生品具有显著的胃肠道毒性,醋炙能显著降低甘遂致小鼠的胃肠道毒性。2.对甘遂醋炙前后乙酸乙酯部位致小鼠胃肠道氧化损伤毒性的机理进行了研究。结果表明,与空白对照组比较,甘遂组胃肠SOD、GSH活性明显降低,MDA、LDH含量明显增高(P<0.05);与甘遂组相比,醋甘遂组胃肠SOD、GSH活性明显增高,MDA、LDH含量明显降低(P<0.05)。提示,甘遂生品对小鼠胃肠道具有明显的氧化损伤,醋炙能够显著降低甘遂致小鼠胃肠道氧化损伤的程度。3.考察了甘遂醋炙前后E-钙粘蛋白和VCAM-1蛋白的表达。与空白对照组比较,甘遂组E-钙粘蛋白表达降低,VCAM-1蛋白表达增强(P<0.05,P<0.01);与甘遂组比较,醋甘遂组E-钙粘蛋白表达增强,VCAM-1蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。提示,甘遂可能通过致炎通路共同造成小鼠胃肠道损伤,而醋炙可在甘遂所致小鼠细胞炎症坏死途径发挥降低毒性的作用。·六、研究了甘遂毒性二萜类成分EK-02对IEC-6细胞的毒性及作用机制研究。1.研究了 EK-02对IEC-6细胞的毒性作用。采用MTT法测定了细胞相对抑制率并计算了半数抑制率IC50,并在倒置显微镜下观察EK-02作用后细胞形态学的改变,实验结果显示,与空白对照组相比,EK-02具有较强的肠上皮细胞毒性(P<0.01),且呈一定的剂量相关性。2.流式细胞术考察了 EK-02对IEC-6细胞的细胞周期和凋亡的影响。结果显示,与空白对照组相比,EK-02能显著诱导IEC-6细胞凋亡(P<0.05,P<0.01),且呈一定的剂量相关性。3.研究了 EK-02诱导IEC-6细胞凋亡的机制。采用高内涵细胞成像系统,结果表明,与空白对照组相比,EK-02能够显著降低大鼠小肠隐窝上皮细胞株IEC-6细胞核Hoechst荧光强度、线粒体膜电位荧光强度(P<0.05,P<0.01),且呈一定的剂量相关性;采用Elisa试剂盒法,结果显示,与空白对照组相比,EK-02能够显著增加大鼠小肠隐窝上皮细胞株IEC-6 的 caspase-3,caspase-8,caspase-9 酶活力(P<0.05,P<0.01),且呈一定的剂量相关性;激光共聚焦显微镜荧光染色法检测细胞内活性氧含量结果显示,与空白对照组相比,EK-02可使细胞内活性氧含量显著增加(P<0.01),且呈一定的剂量相关性;Western-blot分析结果显示,与空白对照组相比,EK-02能够显著上调IEC-6细胞胞浆中细胞色素C、Bax、AIF、Apaf-1蛋白的表达(P<0.01),且呈一定的剂量相关性;能够显著下调IEC-6细胞的Bcl-2蛋白的表达(P<0.01),且呈一定的剂量相关性。提示,EK-02能通过线粒体凋亡路径来诱导IEC-6细胞凋亡。七、研究EK-02水解产物的结构与毒性,探讨甘遂醋炙后二萜醇酯类成分的可能变化。对EK-02采用碱水解法水解,并采用TLC和HPLC法对水解产物进行确认,再采用Q-TOF、NMR等技术对水解产物进行结构确证,最后采用肠上皮细胞IEC-6对水解产物进行毒性评价。结果表明,水解后,TLC显示有一极性比EK-02大的新物质生成,该新物质在醋甘遂中明显存在,而在生甘遂中含量极低。结构分析该成分为巨大戟二萜醇,其对IEC-6细胞的IC50为98.3μM,毒性明显小于EK-02。因此推测甘遂中毒性较大巨大戟烷型二萜醇酯类化合物经醋炙后水解转化为毒性较小的醇,可能是甘遂醋炙减毒的作用机理。