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离子液体作为一种环境友好的绿色溶剂,它的应用领域从合成化学扩展到分离纯化、功能材料等诸多领域。木瓜蛋白酶具有耐高温、稳定性好等特征,多应用于食品、医药等领域。然而传统的提取木瓜蛋白酶的方法存在酶活性低等缺点,无法达到现代工业要求。所以,探索制备高纯度、高活性木瓜蛋白酶的新方法极为迫切。本文从N-烷基吡啶氯盐离子液体的合成开始,将其运用于[CnPy]Cl(n=2,4,6)-K2HPO4双水相体系,探究该体系的相行为及木瓜蛋白酶在体系中的分配行为规律。建立了木瓜蛋白酶在该类双水相体系中的分配模型。通过单因素和响应面实验确定了最佳萃取条件,运用SDS-PAGE电泳检验纯化结果,实验内容如下:(1)离子液体的合成。采用一步法合成N-正乙基吡啶氯盐(EPyCl)、N-正丁基吡啶氯盐(BPyCl)、N-正己基吡啶氯盐(HPyCl),并通过差示扫描量热法(DSC)表征产物纯度。三种产物得率分别为:92.42%、90.07%、85.67%,且DSC表征后,纯度理想。通过L9(34)正交实验得到最佳合成条件为反应温度80℃、时间72h、配料摩尔比n(吡啶):n(氯代烷)=1.0:1.2 mol及溶剂乙酸乙酯用量100 mL。(2)相图的研究。利用清-浊点辅助法,在298.15K温度下,测定了[CnPy]Cl(n=2,4,6)-K2HPO4体系的双节线数据,并绘制三角相图。采用Merchuk方程关联双节线,相关系数均在0.996以上,关联结果较理想。(3)液/液/固边界线的研究。探究了双水相液/液/固边界线的斜率与离子液体的侧烷基链长度、体系温度的关系,并对其进行线性拟合。结果得到斜率与侧烷基链的长度、体系温度以及成相能力均呈负相关。成相能力顺序为:[C6Py]Cl>[C4Py]Cl>[C2Py]Cl。(4)液液相平衡的研究。运用折光率法、酸碱中和法测定了体系中上下相的含量,并利用Othmer-Tobias和Bancroft这两个经验方程关联数据,线性相关系数R2值均高于0.995,方程关联性较强,以此作为建立模型的数据支撑。(5)模型的建立。由于木瓜蛋白酶分配系数K的对数与上下相各组分浓度差的相关度均较高,故用Matlab建立了其在该双水相中的分配模型,相对偏差都低于4%。模型为:LnK=AL+BL2+C其中,L=(wil2+ws2)1/2,wil、ws分别为上下相的离子液体浓度差、盐的浓度差。(6)分配行为的研究。通过单因素实验研究了 K2HPO4浓度、离子液体浓度、酶添加量、pH、温度对木瓜蛋白酶分配行为的影响。通过Box-Behnken响应面法得到最佳萃取条件为 0.35 g/mLK2HPO4,0.25 g/mL[C4Py]Cl,pH 7.87,酶添加量 2.17 mg/mL,温度30℃。与商品酶相比,纯化倍数达到1.88倍,且经SDS-PAGE电泳实验可观察到纯化后的酶杂条带明显减少。本文将合成的离子液体成功运用于双水相体系萃取木瓜蛋白酶,获得了高纯度的酶。为推动高活性高纯度木瓜蛋白酶的工业化制备提供理论指导。