研究背景骨质疏松症(Osteoporosis)是一种退化性疾病,随着年龄增长,患病风险增加。随人类寿命的延长和社会老年化的到来,骨质疏松症已成为人类重要的健康问题。如何促进骨生成,抑制骨吸收,更好更快的促进骨质疏松性骨折的愈合,是治疗的基本原则。近年来,以骨质疏松治疗为中心,双膦酸盐类、降钙素、甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)类,雌激素受体调节剂等手段广泛的应用于临床；并取得了很好的疗效。在骨质疏松性骨折治疗中,组织工程化骨及支架也进入了临床应用的视野。但是,骨质疏松症形成原因、防治方法依然存在许多空白,所以,多种思路的实验研究依然比较活跃。在各类研究中,缺氧诱导因子(Hypoxia inducing factor, HIF)1α与骨质疏松的关系是近些年来的研究热点之一。由于骨质疏松条件下的髓内供血体系的弱化,骨器官整体处于低氧张力的环境下,如果并发骨折,其氧浓度会进一步下降。因此,深入研究骨质疏松的发生机制,探讨HIFla与该疾病的关系,是合理治疗骨质疏松及其并发症的基础。在过去的四十年里,寻找理想的骨替代物受到密切的关注。骨替代组织工程移植物应该具有优秀的骨生成和血管化性能,并迅速整合到骨再生体内。在骨再生过程中建立起完整的内部功能性血管网络,可以提供足够的氧气和营养物质促进增长、分化、和组织功能。然而大部分组织工程支架,都面临着血管化不足,降解过程缓慢的缺点。所以近年来组织工程化骨基本以多孔结构为主,意图促进组织长入,但其血管化机制并未得到深入探讨。目的综合上述分析,本研究拟1在多孔支架中,观察其血管化特征,并探讨HIF1P在其血管化中的作用；2从细胞水平上探讨HIF1α能否应用于抗骨质疏松治疗,并在动物体内验证,进一步研究其作用机制。为抗骨质疏松及骨质疏松性骨折的防治提供新的策略。对象与方法第一部分：多孔磷酸钙(Calcium phosphate cement, CPC)-明胶纤维(Gelatin fiber,GF)支架实验方法1.构建多孔磷酸钙-明胶纤维(CPC-GF)支架先以Ca(NO3)2·4H2O和(NH4)2HPO4·12H2O为原料,用化学沉淀法合成出无定形磷酸钙先驱体,然后迅速将其离心脱水,再冷冻干燥,再经过适当的热处理得到部分结晶的磷酸钙(partially crystallized calcium phosphates,PCCP)。使用球磨机按球磨不同时间将这两种粉体制成具有不同粒度的粉体。添加不同比例明胶纤维。明胶在60。C溶解为液态,然后明胶溶液置入注射器；随着注射器针头冰水冷却,明胶纤维在注射器挤压下成形,获得两种具有不同的直径(250和500um)的凝胶纤维(命名为F250CPC-GF、F500CPC-GF)。以等质量比在玻璃研钵中均匀混合PCCP和无水磷酸钙粉体。按照相同的液固比添加去离子水调和成浆体后,磷酸钙粉混合3wt%(质量百分率)、6wt%明胶纤维填充到模具中,形成圆柱状CPC-GF混合成体,放人37℃、97%湿度的恒温恒湿箱中养护备用。准备样本用于在体外和体内测试。2. CPC-GF材料特征评估。采用万能材料试验机对CPC-GF支架进行抗压测试,每一个标本测量重复6次,计算平均值。分析选定的样本进行微型计算机断层摄影,图像后处理使用CT-Pro:离线重建和VG Studio MAX,创建3D重建影像。评估其致孔性及力学特征。3.多孔CPC-GF支架在体实验及血管化特性评估。在SD大鼠背部皮下,植入不同纤维直径(0m,250m,500m)的多孔CPC-GF支架。动物在术后4和8周后以颈椎脱位法处死,取材后准备组织学分析。组织材料脱钙切片后,进行HE染色,组织免疫荧光,组织免疫组化实验,检测HIF1α、血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A, VEGFA)、胎盘生长因子(Placental growth factor,PLGF)等蛋白在不同分组中的表达,及在组织工程支架不同位置的分布特征。第二部分DFO联合PTH对骨质疏松及骨质疏松性骨折的影响1.原代细胞的提取、培养。为验证HIF1α在体外细胞实验中的成血管及成骨影响,我们分别构建了大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)原代细胞系及人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)原代细胞系。并用流式细胞仪进行了鉴定。2.实验分组3. HIFla及PTH在体外细胞实验成骨、成血管效能的检验BMSCs进行CCK-8(Cell counting kit-8)实验,检测不同浓度及DFO及PTH不同组合配方对细胞增殖的影响；骨髓间充质干细胞定向诱导后,分别给予不同组别干预,然后通过碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色检测其对干细胞成骨方向分化的影响；为观察不同干预措施对体外细胞成血管及细胞趋化能力的影响,在]HUVECs系中应用成小管实验、Transwell实验进行验证；在HUVECs细胞中进行RT-qPCR实验,检测HIF1α及其下游相关转录基因VEGF,趋化因子受体4(Chemokine receptors 4, CXCR4)基因CXCR4的表达,以验证DFO对干细胞的血管化特征的影响；另一方面,在BMSCs中检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因Opn,Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2)基因Runx2,以期了解其对成骨特性的影响；提取骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)细胞总蛋白,检测HIF1α细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)、磷酸化ERK(P-ERK)的表达,探讨其增效机制。实验均重复三次以上。4.搭载DFO及PTH的PLGA.温敏壳聚糖水凝胶支架的构建聚乳酸聚乙醇酸共聚物(Poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)通过w/o/o法制备,2%的壳聚糖溶液45m1,冰浴条件下边搅拌边加入5毫升56%的甘油磷酸钠,冰浴中放置配成凝胶。实验前将载有去铁胺(Deferoxamine,DFO)甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH) PLGA微球加入温敏壳聚糖凝胶中,搅拌均匀,25度水浴10分钟。备用。取该种支架进行药物体外释放动力学实验。5.骨质疏松及颅骨缺损模型构建通过切除雌性大鼠双侧卵巢构建去卵巢骨质疏松(Ovariectomized osteoporosis OVX)大鼠模型,在OVX模型中,应用腹腔注射方法进行不同药物组合干预,评估其抗骨质疏松作用。分组：A.假手术组(包埋空双微球)B.模型组(包埋空双微球)C.骨缺损部位包埋DFO微球组D.骨缺损部位包埋PTH微球组E.骨缺损部位包埋DFO及PTH微球。在评估OVX造模方法成功后,在OVX模型上构建颅骨缺损模型。并在该种骨质疏松颅骨缺损模型中,应用搭载不同药物的支架。支架微球组合如下：6.DFO与PTH联合应用对动物抗骨质疏松及骨折的实验研究。为评估DFO、PTH全身用药对OVX大鼠模型骨质的影响,我们在药物注射干预2月后,脱颈处死动物,取材固定后,应用MicroCT扫描大鼠股骨粗隆间部,采用BMD,BV/TV, Tb.N, Tb.Sp, Tb.Th指标评估骨组织形态。统计方法计量资料用均数±标准差显示。采用SPSS 13.0 (Chicago,IL, USA)进行统计学分析,采用完全随机设计方差分析,方差齐性检验方差齐时,采用q检验,采用Student-Newman-Keuls (S-N-K)检验方法进行组间两两比较统计(方差齐),方差不齐时采用Tamhane’T2法进行两两之间的比较统计(方差不齐),P<0.05作为有统计学差异。结果第一部分：多孔CPC-GF支架实验方法CPC-GF支架明胶纤维随机分布在磷酸钙块体结构中。随着CPC-GF支架中明胶含量的增加,支架的孔隙率显示了增加的趋势。将支架材料横截面的孔隙大小分布可视化,显示血管可以通过这些多孔渠道长入。明胶纤维在CPC-GF支架结构中诱导形成更高的孔隙互联互通。F250CPC-GF支架纤维孔隙分布明显比F500CPC-GF纤维更多；但F500CPC-GF通道的平均尺寸比F250CPC-GF更大。F500CPC-GF和F250CPC-GF两种支架中,当明胶纤维的重量从3.0wt%增加到6.0wt%,其抗压强度分别下降(One-Way ANOVA; P< 0.05)。F500CPC-GF和F250CPC-GF (内含中空通道),随着明胶纤维重量的增加(3wt%-6.0wt%),他们抗压强度相应减少。两种3.0wt%明胶纤维支架材料抗压强度(超过10 MPa)高于6.0wt%明胶纤维支架材料(少于10 MPa)。3.0wt%的凝胶纤维组,当样品水化后形成中空管道后,他们的抗压强度略有增加；6.0wt%的凝胶纤维支架水溶后,其抗压强度显著降低。随着纤维含量增加到9wt%和12wt%,由于凝胶材料水混合后的肿胀属性,抗压强度的数据无法获得。因此,3.0wt%凝胶纤维组,其样品抗压强度相对高于没有纤维的样品。手术后4周,组织学评价表明,在对照组没有发现组织长入。明胶纤维降解后,F500CPC-GF组和F250CPC-GF支架组明胶纤维降解后通道内发现大量肉芽组织,伴随着一些炎性细胞标本。此外,在降解后形成的多孔交联通道内发现大量的血管样结构。血管样结构内含有红细胞和内衬的单层细胞。CPC-GF支架植入八周后,F500CPC-GF和F250CPC-GF支架组肉芽组织明显增加,纤维通道组织内未发现炎性细胞浸润。此外,8周时F250CPC-GF支架组血管样结构与4周时相比,明显增加。而4-8周时,F500CPC-GF支架组血管样结构的密度没有变化。我们计算了每组标本,长入组织支架纤维降解通道内大鼠组织的CD31阳性的血管密度。F250和F500CPC-GF支架组的孔道内,新生成血管迅速发展。在4周和8周,实验组和对照组之间有统计学上显著差异。植入后8周后,F250CPC-GF支架组的血管密度为8.12±0.23,这在所有实验组内数值最高,相对于4周增加了60%(6.1±0.11)。F500CPC-GF支架组作为阳性对照,8周时,相比4周时,并没有显示明显的变化。为了分析CPC-GF支架纤维降解后,形成通道内CD31标记的血管直径大小,使用奥林巴斯显微镜数字化测量软件计算这些区域内的血管直径。4周后F500CPC-GF支架组毛细血管的直径范围从4到20um,平均直径7.8um。8周后F500CPC-GF支架组血管直径增加到平均直径16.2um(范围5um到45um)。相反,F250CPC-GF支架组血管直径集中在5-10um(范围5um至18um)直径分布集中,不分散。虽然8周后F250CPC-GF支架组血管直径增加的趋势类似,但血管直径要小于F500CPC-GF组。F500CPC-GF支架组血管完全填满红细胞,管腔开放很明显。定量分析表明,4周和8周时两者之间的差异组显著。总起来说,这些结果表明,F500CPC-GF支架组比F250CPC-GF支架组更倾向于形成大直径血管(图8 d)。为测试是否明胶纤维降解后形成的不同直径管道在HIF1α诱导的血管化过程中发挥了重要作用,标本进行了CD31和HIF1α免疫荧光染色。管状结构和拱桥样通道中的CD31阳性表达增加,而对照组支架没有CD31染色和显示DAPI表达。分析CPC-GF支架中每屏幕DAPI阳性的细胞表明F250CPC-GF支架组相比F500CPC-GF支架组包含更多DAPI阳性细胞,尽管F250CPC-GF支架组管腔更小。此外,免疫荧光染色显示移植后4周F250CPC-GF支架组相比F500CPC-GF支架组HIF1α蛋白表达显著增强,对照组没有HIF1α或CD31染色。通过组织免疫荧光检测CPC-GF支架组移植术后4周,血管生成因子(PLGF, VEGF-A, CXCR4)的表达,进一步研究了不同直径纤维通道对血管生成和细胞迁移的影响。尽管F250CPC-GF支架组有更多的血管(Fig9c、f),但几乎只有8%的细胞VEGF-A阳性,而相比F500CPC-GF支架组有25%组织表达阳性。与VEGF-A表达提高相比,F500CPC-GF支架组非典型血管生成因子PLGF表达减少,但F250CPC-GF支架组相对高表达(细胞总数的18%)。此外,F250CPC-GF支架组多达45%的总细胞趋化因子受体CXCR4 (HIF通路下游因子)染色阳性。CXCR4免疫荧光同样支持先前HIF1α染色,结果表明,生长在F250CPC-GF支架组中细胞归巢,祖细胞迁移,生存率明显高于F500CPC-GF支架组。这些数据表明,F250CPC-GF支架组与F500CPC-GF支架组中,随着通道直径增加HIF1α蛋白表达减少,反之则HIF1α、CXCR4、PLGF表达增加。另一方面,F500CPC-GF支架组纤维管道直径增加,增强VEGF-A表达(图9f)。为了探索HIF1α的表达是否在CPC-GF支架不同位置发生改变,我们选择免疫组织化学进行分析。相比CPC-GF支架组边界和支架外部组织,位于支架中心的大鼠组织HIF1α阳性表达增强明显。免疫组织化学染色显示,HIF1α阳性细胞在CPC-GF支架组边缘明显变弱,但优于CPC-GF支架组外的组织,在这里几乎没有表达。总起来说,在支架纤维管道内HIF1α蛋白的表达,从CPC-GF支架组的中心部位到边缘部位,逐渐梯度增强。值得注意的是,在CPC-GF支架组中纤维交汇区域,HIF1α阳性表达细胞比未交叉区域明显增加,表明在该位置存在更明显的组织低氧张力。HIF1α阳性细胞的聚集也表明,在纤维通道交叉区域有更强的氧、营养物质的需求,其有利于组织向通道内浸润,在缺氧条件下血管出芽和血管生成潜力更强。我们在CPC-GF支架边缘纤维通道内,观察到大量CD31阳性管腔从外向心长入,表明的CPC-GF支架边缘正常宿主组织血管从宿体向移植物长入,这受益于HIF1α在CPC-GF支架组纤维管道内逐渐梯度增加的表达(图10 a,c)。第二部分DFO联合PTH对骨质疏松及骨质疏松性骨折的影响CCK-8实验表明：随DFO浓度的增加,BMSCs的存活率逐渐降低。24h时各组差异不明显(P>0.05)。48h时,D3+PTH组细胞存活率较空白组有显著降低(P<0.05).其他各组差异不明显。72h后,D2、D3组/D2+PTH、 D3+PTH较对照组有显著差异(P<0.05)；D2+PTH、D3+PTH组与单用相同浓度DFO组相比,细胞存活率升高,差异有统计学意义(P<0.05).而3个时间段,PTH组与D1+PTH两组,与对照组相比较均无显著性差异(P>0.05)。因此,DFO虽可能促进BMSCs血管生长因子的表达,但在中高浓度时,对BMSCs的细胞增殖均有时间,剂量依赖的抑制作用。Transwell实验中,DFO与PTH合用对HUVECs细胞迁移能力影响的检测：加药24h后进行Transwell结果统计。重复3次实验的结果显示：黏附于上室基质膜上的细胞数量,单纯下室放置基础培养基内,穿模细胞迁移数目较少,未见细胞贴壁生长。空白未加药组：细胞计数为：51.25±3.56,三梯度DFO细胞迁移数目随浓度增加而增加,结果分别为75.31±15.67、88.15±14.95、145.23±20.30,与空白组对照,P<0.05,差异有统计学意义。PTH组细胞迁移数目为60.1±5.46,与空白组相比,无明显差异(P>0.05)。而DFO与PTH合用组,细胞迁移数目明显增加,除D1+PTH组外,中高浓度组细胞迁移数目较单用有统计学差异(P<0.01)。成小管实验结果显示,实验结果显示,对照无加药组HUVECs细胞在Matrigel基质胶基本不能形成小管状结构,管腔数目极少,且面积小。经不同浓度DFO作用后的HUVECs细胞相连呈网状,小管形成面积逐渐增加。不同浓度DFO组小管形成面积分别为0.154±0.041 mm2、0.235±0.039 mm2、0.392±0.051mm2。而对照组形成的HUVECs小管面积明显低于药物干预组,其面积为0.058±0.004 mm2。PTH组小管形成面积(0.083±0.012 mm2)与对照组相比无差异(P>0.05)。与PTH合用后,小管形成面积显著增加。合用药物作用组与对照组、单用DFO组之间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。ALP染色实验表明：单用DFO药物干预,与之前结果类似,ALP和钙化结节逐渐减少。然而,加用PTH后,虽然随DFO浓度增加,ALP染色依然依次降低,但其降低幅度明显减轻。为探讨该种作用是否与PTH经典ERK-MAPK通路是否有关,我们在组2的基础上加用ERK阻断剂PD98059,结果显示这种减轻成骨方向诱导抑制的作用消失。Rrt-qPCR研究表明DFO在mRNA水平调节成骨和成血管因子的表达,中高浓度合用组增强这种效应。尤其高剂量DFO与PTH合用组,促进Vegf mRNA的表达,促进Cxcr4、Sdf1的表达,改善DFO对成骨因子Opn及Runx2的抑制作用,但同时在BMSCs中提高凋亡因子p53mRNA水平。而在低浓度DFO组,这种协同作用并不明显。我们继续在正常大鼠原代BMSCs中提取蛋白进行WB实验,实验表明,DFO与PTH合用在高浓度组显著促进HIF1α的表达(P<0.01)。我们继续设计了低高浓度DFO、与PTH合用、在合用基础上加用ERK上游激酶MEK1抑制剂-PD98059的组合。实验结果表明,PTH及合用组P-ERK的表达显著提升,而应用ERK上游激酶MEK1抑制剂-PD98059后,P-ERK表达显著下降(P<0.01)。于此同时,HIF1α表达在抑制剂组显著下调(P<0.01)。骨质疏松模型成功建立。在应用DFO及PTH全身用药动物实验中,建立OVX模型后,大鼠松质骨,骨小梁的连接性明显降低；而DFO处理的大鼠骨小梁厚度较模型组对比,骨小梁有增加的趋向,其他骨质疏松指标也有一定程度改变,但DFO与OVX模型组相比,无明显差异(P>0.05)；两种药物同时处理大鼠时,松质骨各指标迅速改善(P<0.01)。为评估DFO、PTH局部用药对OVX骨质疏松大鼠模型颅骨缺损愈合的影响,我们在载药PLGA微球-温敏明胶支架植入2月后,取材固定,应用MicroCT扫描大鼠颅骨骨缺损部位,MicroCT扫描结果显示,OVX造模组与假手术SHAM组相比,骨质疏松大鼠颅骨缺损处愈合面积明显降低,DFO组局部应用与假手术组和OVX组比较,不但不增加愈合面积,骨愈合进程基本停滞,PTH组明显增加骨缺损部位的骨痂生长,DFO+PTH组骨缺损部位骨痂规律生长,在缺损全层形成散布骨化部位,骨愈合进程良好。取局部骨再生部位做组织化学分析,显示DFO+PTH组同时促进CD31、Runx2的表达。HE染色证实,新生骨量比其他各组均明显提高。结论1、我们首先在CPC-GF支架皮下包埋的实验中发现,在狭窄的多孔支架通道中,HIF1α有较高的表达；明胶纤维支架通过提高HIF1α、VEGF-A、PLGF、CXCR4表达而实现内皮前体细胞的归巢和促进血管化,通道外部到内部的HIF1α表达梯度增强,这种HIF1α的梯度浓度差异,诱导支架外部血管向心性长入。2、构建了一个促进血管化的新策略,不同的通道大小诱导不同的体内血管化进程。加深组织工程血管化进程的理解,应用该特性,可以在组织工程支架中人为的控制不同级别血管的分布,可以更好克服组织工程支架降解难、血管化差的缺点。3、在我们的第二步实验中,发现单用DFO药物干预,虽促进了血管化,但其对干细胞成骨向分化、细胞增殖方面的负面作用明显。细胞实验及在体实验均证明了这一点。为改善其对骨生成的作用,我们进一步加用PTH,两药合用时,PTH通过经典cAMP-PKC通路,激活PKC,活化c-raf,通过下游raf→MEK1/2→ERK1/2一系列级联酶促反应促进Hif1α的转录活性,但蛋白水平未变化。由于应用DFO抑制了常氧条件下脯氨酸羟化酶(prolyl-hydroxylase domain,PHD)对HIF1α蛋白的羟基化,使其不能有效降解,使转录增加的HIF1α蛋白表达显著增加。小剂量PTH可以激活ERK-MAPK通路,通过该通路,可以促进Opn及Runx2的转录表达;而DFO与PTH合用可以提高ERK的磷酸化水平,提高活化因子P-ERK的水平。所以合用组的成骨因子指标并未降低,其大大改善因HIF1α积累而引起的成骨抑制作用。4、我们对DFO与PTH联合应用治疗骨质疏松性骨折及抗骨质疏松的研究,克服了单独应用DFO或其他HIF1α增益剂引起的抑制成骨作用,丰富了抗骨质疏松的治疗方案,由于DFO及PTH已经是临床用药,这对指导临床上治疗骨质疏松也具有重要意义。