[背景目的]结核病（TB）亚单位蛋白疫苗,与卡介苗（BCG）和其它类型的疫苗相比,更具安全性。目前,已经提出不同策略发展亚单位蛋白疫苗,并且有五种亚单位蛋白疫苗临床试验。为了发展更加有效的、建立在细胞介导免疫应答为基础的TB亚单位蛋白疫苗,本文拟构建包含结核分枝杆菌（Mycobaterium tuberculosis, M. tb）5个具有CD8+T细胞表位的抗原,即CFP10, TB10.4, TB8.4, Rv3615c和HBHA的融合蛋白CTT3H。原核表达和纯化该蛋白,建立TB亚单位蛋白侯选疫苗CTT3H/DMT佐剂（DDA/MPL/TDB）,并评价了其免疫原性和保护性。[方法]1.菌株及其培养：BCG和M. tb H37Rv用7H9或7H11培养基（补充10%ADC,0.5%甘油和0.05%吐温80）培养；E.coli DH5a菌株和BL21（DE3）菌株用LB固体或液体培养基培养,分别用于克隆和表达。2.融合蛋白CTT3H的构建表达、纯化和SDS-PAGE和Western blotting鉴定。3.薄膜法制备亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT:DMT佐剂（100μL/dose）包含250μg DDA,和50μg TDB。先用薄膜法制备DMT佐剂,然后将DMT佐剂与融合蛋白CTT3H混合均匀。200gL亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT包含100μL DMT和100μL融合蛋白CTT3H （20μg）。4.评价亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT抗M. tb H37Rv感染保护性（n=6）：SPF级6-8周龄C57BL/6雌性小鼠,皮下给予0.2mL亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT作为实验组,免疫两次,间隔3周；BCG （1.2x10⁶CFU/200μL/只）作为阳性对照组；PBS作为阴性对照组（200μL/只）：DMT佐剂为佐剂对照组（100μL PBS+100μL DMT/只）。木次免疫C57BL/6小鼠3周后,气溶胶方式感染60CFU M. tb H37Rv毒株。感染4周后,分别检测小鼠脾、肺脏的细菌载量和病理改变。5.评价亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT的细胞免疫应答：免疫C57BL/6小鼠方式同上,末次免疫后3周,收集脾细胞。1) ELISA检测CTT3H特异的IFN-y, RPMI1640为阴性对照,以PPD刺激为阳性对照（n=3）。2)流式细胞术结合胞内细胞因子染色法分析CTT3H特异的CD4+和CD8+T细胞中分泌TNF-a⁺、IFN-γ⁺、IL-2⁺的细胞总数。RPMI1640为阴性对照,以PPD刺激为阳性对照（n=3）。3) CFSE标记法检测体内TB10.4肽特异的CD8+T细胞CTL效应（n=3）。6.评价亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT的体液免疫应答（n=3）：ELISA检测小鼠血清中CTT3H特异的抗体总IgG及亚类IgG1、 IgG2c （结果分析时用IgG2a代替）的水平。7.使用SPSS18.0软件和单因素方差分析进行统计学比较,p<0.05具有统计学意义。[结果]1.融合蛋白CTT3H大小为61kDa,被成功表达、纯化和鉴定。2.亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT抗M. tb H37Rv原发感染的保护性：所有组中,PBS组的脾、肺脏的荷菌量均最高（p<0.05）,组织病理学最严重,抗酸染色阳性菌遍布小鼠的肺部,并在实变区发现大量抗酸菌。亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT组脾、肺脏与PBS组和单独佐剂组相比,可有效的抑制Mbtb的生长,零星的肉芽肿样实变区域,且M.tb较少。亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT组织病理评分与BCG相当。3.亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT诱导产生抗原特异性的细胞免疫应答：1)PBS组仅产生低水平PPD或CTT3H特异的IFN-y水平。BCG组诱导最高水平PPD特异的IFN-y水平（p<0.05）。亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT组PPD和CTT3H特异的IFN-y水平显著高于PBS组和DMT佐剂组（p<0.05）。2)与PBS组和DMT佐剂相比,BCG和亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT诱导产生更高水平PPD或CTT3H特异的IFN-γ⁺或IL-2⁺CD4⁺和CD8+T细胞以及TNF-α⁺CD4⁺T细胞（p<0.05）。尤其是,与BCG相比,亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT组产生更高水平PPD或CTT3H特异的IFN-γ⁺或TNF-a+CD4+和CD8+T细胞（p<0.05）。另外,BCG组抗原特异的IL-2+CD4+和CD8+T细胞水平与亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT组无统计学意义。3)BCG组和DMT佐剂组的杀伤率低于亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT组（p<0.05）。4.亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT诱导产生CTT3H特异性的体液免疫应答：亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT组CTT3H特异的IgG,IgGl或IgG2a抗体水平最高（p<0.05）。BCG组CTT3H特异的抗体水平较低。DMT佐剂组未产生CTT3H特异的抗体。仅亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT组IgG2a/IgGl显著增加,提示IgG亚类转向Thl型反应（p<0.05）。[结论]DMT是一种较为有效的TB亚单位蛋白疫苗候选佐剂。亚单位蛋白疫苗CTT3H/DMT是一种有效的TB候选疫苗。[背景目的]尽管BCG作为TB唯一的预防疫苗且广泛推广应用已50余年,但是TB仍然是最严重的感染性疾病之一。亚单位蛋白疫苗是发展TB新型疫苗的重要策略,相对于其它类型疫苗或BCG接种免疫缺陷人群,更具安全性,而且还可能取代BCG用于免疫预防。为了获得有效的亚单位蛋白疫苗,前期我们依据不同的策略,已构建了四种亚单位蛋白疫苗A1D3R1（Rv3407-PhoY2-Ag85A-Rv2626c-RpfB）/MTO, A1D4（Rv1813-Rv2660c-Rv2623-HspX）/MTO, CTT3H （CFP10-TB10.4-TB8.4-Rv3615c-HBHA）/DMT,和CMFO （CFP32-MTB70-Rv3044-Rv2073c）/DMT（或MTO）,分别免疫C57BL/6小鼠,均证实具有较好的免疫原性,且能提供显著增强的抗M.tb原发感染的保护性,但是保护性均不及BCG。为了发展更为有效的亚单位蛋白疫苗,本研究拟将四种融合蛋白（A1D3R1、 A1D4、 CMFO和CTT3H）等比例混合并结合DMT佐剂,构建成新型的包含19个抗原的TB亚单位蛋白疫苗AACC/DMT,并评价其免疫原性和抗M.tb原发感染的保护性。[方法]1.纯化和鉴定融合蛋白A1D3R1、 A1D4、 CMFO和CTT3H。2.制备亚单位蛋白疫苗AACC/DMT。3.评价亚单位蛋白疫苗AACC/DMT抗M. tb H37Rv原发感染的保护性（n=6）：SPF级6-8周龄C57BL/6雌性小鼠,皮下注射0.2mL亚单位蛋白疫苗AACC/DMT作为实验组,免疫两次,间隔3周;BCG（10⁶CFU/200μL/只）作为阳性对照组；PBS作为阴性对照组（200μL/只）。免疫C57BL/6小鼠18周后,气溶胶方式感染60CFU M. tb H37Rv毒株。感染4周后,分别检测感染小鼠脾、肺脏的荷菌量和肺脏病理改变。4.评价亚单位蛋白疫苗AACC/DMT的细胞免疫应答：C57BL/6小鼠及免疫方式同上,初次免疫后9周和18周,分别收集脾细胞。1) ELISA检测A1D3R1、 A1D4、 CMFO和CTT3H特异的IFN-y, RPMI1640为阴性对照,以PPD刺激为阳性对照（n=6,初次免疫小鼠9周和18周后各3只）。2)流式细胞术结合胞内细胞因子染色法分析A1D3R1、 A1D4、 CMFO和CTT3H特异的CD4+和CD8+T细胞中分泌IFN-γ⁺、IL-2⁺的细胞总数。RPMI1640为阴性对照,以PPD刺激为阳性对照（n=6,初次免疫小鼠9周和18周后各3只）。3) CFSE标记法检测体内TB10.4和Ag85B CD8⁺表位肽特异的CTL效应（n=6,初次免疫小鼠9周和18周后各3只）。5.评价亚单位蛋白疫苗AACC/DMT的免疫记忆（n=6,初次免疫小鼠9周和18周后各3只）：以CD44.CD62L表达作为分选标志,利用流式细胞术,分别检测A1D3R1、 A1D4、CMFO、CTT3H和PPD特异的TEM(CD62L^lowCD44^high、 T_CM(CD62L^highCD44^high细胞数量；结合胞内因子染色法,进一步分析TCM细胞群中分泌IL-2和TEM细胞群中分泌IFN-y的细胞数量。6.评价亚单位蛋白疫苗AACC/DMT的体液免疫应答（n=6,初次免疫小鼠9周和18周后各3只）：ELISA检测小鼠血清中A1D3R1、 A1D4、 CMFO和CTT3H特异的抗体总IgG及亚类IgG1、 IgG2c（结果分析时用IgG2a代替）的水平。7.使用SPSS18.0软件和单因素方差分析进行统计学比较,p<0.05具有统计学意义。[结果]1.蛋白纯化和鉴定：成功纯化A1D3R1、 A1D4、 CMFO和CTT3H四个融合蛋白。SDS-PAGE电泳和Western blotting进一步鉴定其分子量分别为121kDa、105kDa、117kDa和61kDa,与课题组以前的报道一致。2.亚单位蛋白疫苗AACC/DMT免疫的抗Mt6原发感染保护性：亚单位蛋白疫苗AACC/DMT免疫组,与PBS组相比,可显著降低M.tb原发感染小鼠脾、肺脏的荷菌量（p<0.05）,其脾脏、肺脏荷菌量与BCG组相当。特别是亚单位蛋白疫苗AACC/DMT免疫能提供比BCG组更轻的肺脏病理学改变。3.亚单位蛋白疫苗AACC/DMT诱导的细胞免疫应答：1)与PBS组相比,亚单位蛋白疫苗AACC/DMT诱导免疫小鼠脾细胞分泌高水平且持久升高的A1D3R1、A1D4、 CMFO和CTT3H抗原特异的IFN-7（p<0.05）。2)与PBS组比较,亚单位蛋白疫苗AACC/DMT诱导产生A1D3R1、 A1D4、 CMFO、 CTT3H特异的IFN-γ⁺CD4⁺T细胞数显著增高,且持久地增加（p<0.05）。3)初次免疫9周后,亚单位蛋白疫苗AACC/DMT免疫诱导较高水平的靶向TB10.4和Ag85B抗原肽的特异性杀伤率,均显著高于BCG组（p<0.05）；初次免疫18周后,亚单位蛋白疫苗AACC/DMT靶向TB10.4和Ag85B抗原肽的特异性杀伤率均显著降低且低于BCG组（p<0.05）。而BCG靶向TB10.4和Ag85B抗原肽的特异性杀伤率随着时间的延长显著升高（p<0.05）4.免疫记忆：与PBS组相比,亚单位蛋白疫苗AACC/DMT免疫诱导的A1D3R1、 A1D4特异的CD4⁺T_EM. CD4⁺T_cM和CD8⁺T_CM细胞数量以及CMFO、 CTT3H和PPD特异的CD8+TCM细胞数量显著增高,且持久地增加（p<0.05）；A1D3R1、A1D4、CMFO、 CTT3H特异的IL-2⁺CD4⁺T_CM或IL-2+CD8⁺T_CM细胞数量显著增高,且持久地增加（p<0.05）。5.体液免疫应答：亚单位蛋白疫苗AACC/DMT免疫小鼠能够诱导产生A1D3R1、 AlD4、 CMFO和CTT3H特异且持久的Thl型抗体应答（p<0.05）。[结论]TB亚单位蛋白候选疫苗AACC/DMT,提供与BCG相当的抗M.tb感染保护性并减轻肺脏病理改变。因此,AACC/DMT可作为TB亚单位疫苗的候选疫苗,可进一步应用于临床前评价和临床试验。