论文部分内容阅读
目的：本实验的PKCε重组腺病毒载体通过pAdEasy腺病毒载体系统构建,感染大鼠原代心肌细胞,利用western-blot技术在蛋白水平检测PKCε的表达,并且通过MTT法检测细胞存活率,从而证实重组载体构建成功。方法：采用PCR法从野生型PKCε质粒中扩增PKCε基因的全长cDNA,将纯化后的cDNA与pShuttle-CMV分别用Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切,低熔点琼脂糖凝胶电泳回收所需片段,再将二者连接转化至大肠杆菌,提取重组质粒pShuttle-CMV-PKCε,进行酶切及核苷酸序列测序鉴定。在大肠杆菌BJ5183中将穿梭质粒PShuttle-CMV-PKCε与骨架质粒pAdEasy-1进行化学转化,同源重组形成PKCε/pAdEasy-1重组质粒,提取纯化质粒,Pac Ⅰ酶线性化,磷酸钙法转染HEK293细胞,包装成为完整的病毒,收集病毒。重复感染HEK293细胞,扩增收集病毒,纯化病毒。PKCε腺病毒感染大鼠原代心肌细胞。通过western-blot技术在蛋白水平检测PKCε的表达,并且通过MTT法检测细胞存活率,从而证实重组腺病毒载体构建成功。结果：通过酶切鉴定及基因测序证明,重组穿梭质粒PShuttle-CMV-PKCε质粒构建成功。带有目的基因的穿梭质粒与骨架质粒在BJ5183中同源重组,在HEK293细胞中包装至完整病毒,扩增得到高滴度的病毒,利用western-blot法检测PKCε蛋白表达上调,通过MTT法检测心肌细胞存活率显著增高,确证得到高表达的腺病毒载体。结论：成功构建PKCε蛋白腺病毒表达载体,并成功感染大鼠原代心肌细胞,通过western-blot技术在蛋白水平检测PKCε的表达,MTT法检测心肌细胞存活率,确定PKCε蛋白腺病毒表达载体构建成功,为继续研究PKCε的心肌保护作用提供工具。