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干扰素-ω(IFN-ω)是近年来新发现的一种干扰素,具有广谱抗病毒、增强免疫功能、对细胞增长抑制等作用,在临床治疗方面有着广泛的应用前景。目前重组人干扰素-ω(rHu IFN-ω)的基因表达、纯化、性质等方面的研究已经完成,现正进行临床药动学,药效学的研究,而建立可靠的测定方法是其研究的前提和关键。通过对各种研究方法的综合比较,发现酶联免疫吸附测定法(ELISA)具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点,因此本文建立了血液中定量检测rHu IFN-ω的双抗夹心ELISA。具体研究内容如下:①兔抗rHu IFN-ω多克隆抗体的制备与纯化用rHu IFN-ω与福氏佐剂免疫新西兰白兔制备抗血清,将制得的抗血清首先经饱和硫酸铵三级沉淀(50 %、40 %、33 %)纯化,再用DEAE柱进一步纯化,分部收集并结合电泳选取纯度高的部分,用间接ELISA实验测定纯化抗体效价,Lowy法测定抗体的浓度,得到了用于双抗夹心ELISA的抗体。②酶标抗体的制备应用戊二醛二步法将纯化的抗体与辣根过氧化物酶交联制备酶标抗体,用Superdex-200凝胶过滤层析分部收集并结合ELISA测定活性,将标记的抗体、未标记的抗体、未标记的酶分开,得到了用于双抗夹心ELISA的酶标抗体。③双抗夹心ELISA最佳反应条件的选择和标准曲线的制作方法用棋盘法确定双抗夹心ELISA最佳实验条件如下:抗体包被浓度50μg/mL,酶标抗体稀释度1:100。并在此条件下制作标准曲线,建立了在原倍血清介质中、稀释5倍血清介质中和稀释10倍血清介质中测量rHu IFN-ω的3条标准曲线。结果表明,当rHu IFN-ω浓度在15pg/mL~480pg/mL之间时,rHu IFN-ω标准品浓度值的自然对数与OD值之间具有良好的线性关系,3条标准曲线的r值均大于0.98,且随着血清介质稀释倍数的增加线性和特异性更好。④方法学考察对本文所建立的双抗夹心ELISA进行了方法学考察,线性检测范围:15pg/mL~480pg/mL;检测下限:15pg/mL;批内精密度考察:对不同浓度rHu IFN-ω分别测定8次,其CV值在1.12%~5.04%之;批间精密度考察:选择不同浓度rHu IFN-ω连续测定7天,其CV值在3.04%~10.7%;回收率考察:选择高、中和低浓度的rHu IFN-ω分别测定6次,测得回收率在103.26%~105.47%。满足血液中rHu IFN-ω药物测定要求。本文所建立的血液中定量检测rHu IFN-ω的双抗夹心ELISA特异性强、灵敏度高、操作简单,适于体内rHu IFN-ω药物的定量研究,且为rHu IFN-ω药动学及临床研究提供了方法依据和实验参数。