论文部分内容阅读
脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)等中枢神经系统损伤往往会造成机体出现截瘫症状,给个人、家庭乃至整个社会都会带来巨大的压力。研究表明,成年哺乳动物脊髓损伤后再生比较困难。影响损伤修复和再生的因素很多,其中最主要的是中枢微环境中存在轴突再生抑制因子及胶质瘢痕的形成。因此通过直接干预抑制因子的信号通路,促进神经再生,可能是治疗脊髓损伤的有效手段之一。Nogo-A蛋白作为一种重要的抑制因子,以Nogo-66、Amino-Nogo为主要靶点抑制了神经突的生长及诱导生长锥的塌陷,参与介导下游多种受体的神经再生抑制信号;核酸疫苗接种是近年发展的一种治疗中枢神经损伤的有效策略,具有不产生有害自身免疫反应、不存在血脑屏障及微渗透泵损伤的优点;Fms样酪氨酸激酶受体 3 配体(Fms-like tyrosine kinase receptor-3 Ligand,Flt3L)是一种早期造血生长因子,可作为一种免疫佐剂或耐受刺激物来提高机体对抗原产生的免疫反应。基于以上分析,本研究通过基因工程方法分别克隆Nogo-66、Amino-Nogo及Flt3L,构建靶向复合Nogo核酸疫苗;体内观察疫苗接种对Nogo信号的抑制作用及对损伤脊髓的修复作用,体外观察抗血清对神经元细胞模型突起生长的影响及神经保护效应,进而为脊髓及其它CNS损伤后的治疗及药物开发提供新的方法和理论依据。主要方法和技术路线:1.载体的构建、鉴定与表达检测通过PCR扩增Flt3L、Nogo-N、Nogo-66目的片段,最终构建重组真核表达载体pcDNA-Flt3L-NogoN-Nogo66,然后进行PCR、酶切和测序鉴定。脂质体法转染中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)细胞,免疫荧光技术及Western-blot法检测在其在细胞中的表达情况。2.靶向复合Nogo核酸疫苗的制备及免疫将重组质粒pcDNA-Flt3L-NogoN-Nogo66转化E.coli DH5α后,用大量弃内毒素的重组质粒;以脂质体为免疫佐剂、按不同体积比(2:1、1:1、1:2)混匀得到复合核酸疫苗。以远交群(Sprague Dawley,SD)大鼠为研究对象,在大鼠后肢双侧股四头肌多点按100μg/次/周肌肉注射,持续免疫6w,每次免疫前尾静脉取血分离得到抗血清,用酶联免疫吸附法检测其抗体效价,比较并获得最佳制剂。3.体外实验检测抗血清对神经元突起生长的影响及保护作用用上述最佳制剂免疫动物获得的抗血清刺激神经元细胞模型PC12细胞24h,光学显微镜下直接观察细胞突起长度并采用流式细胞术检测刺激后细胞的凋亡情况,探讨抗血清对神经元突起生长的影响及对细胞的保护效应。4.靶向复合Nogo核酸疫苗的免疫学效果评价用上述最佳制剂免疫大鼠6w后制备脊髓半横切损伤模型,并对其进行神经功能行为学观察、病理学检测、神经示踪检测及免疫组化等方法观察靶向复合Nogo核酸疫苗对脊髓损伤大鼠的功能恢复情况以及轴突的再生情况,探讨其免疫学效果。5.初步的安全性检测免疫过程中通过统计大鼠变态反应性脑脊髓炎发生率及体重变化初步评价其安全性,灌注取材后取少量心、肝、脾、肺、肾、血液、注射部位肌肉经PCR扩增,观察免疫质粒在体内的残留情况。主要结果及结论:1.阳性克隆的PCR、酶切及测序鉴定结果表明成功构建了真核表达载体pcDNA-Flt3L-NogoN-Nogo66,免疫荧光及Western blot检测结果表明其能够在体外成功表达相应具有生物学活性的融合蛋白。2.以脂质体为免疫佐剂成功制备靶向复合Nogo核酸疫苗,并免疫动物获得了相应的抗血清。3.抗血清的抗体滴度检测结果显示当质粒与脂质体按1:1的体积比混合免疫效果最佳,靶向复合疫苗对免疫动物的免疫原性较强。4.抗血清的抗体效价检测及体外细胞实验表明复合疫苗刺激机体产生了相应的抗体,且具有促进神经元细胞突起生长的作用,同时还能抑制其凋亡,表明其对神经元细胞的生长具有一定的保护作用。5.成功制备了稳定的脊髓半横切损伤模型,实验观察表明:制备的复合Nogo核酸疫苗能有效地促进运动功能的恢复及损伤脊髓的修复;行为学、病理学、神经示踪等统计结果均说明复合疫苗具有抑制Nogo信号介导的神经再生抑制效应,能够促进损伤动物运动功能的改善及损伤脊髓的修复。6.初步的安全性检测结果表明复合疫苗免疫后,大鼠的体重、活动、饮食等与正常喂养大鼠无明显区别,且损伤6w后组织的PCR结果均呈阴性。表明此种疫苗是相对安全的,且损伤6w后在体内无残留现象。