云南不同生境来源苔藓可培养内生放线菌多样性分析及抗青枯病活性研究

来源 :东北农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jw_wanghaibing
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至今为止的国内外文献中大多数的内生放线菌研究都集中于维管束植物,但是针对苔藓内生放线菌的研究却不是很多。因此,通过苔藓植物内生放线菌的分离,了解其内生放线菌的多样性,将为放线菌新物种及新结构次级代谢产物的发现带来新的机遇。番茄青枯病因其发病率高难以防治被称为“植物癌症”,一旦染病会致使番茄严重减产甚至绝产。目前,针对于番茄青枯病的防治手段以化学防治为主,但是长期的化学农药的施用会使病害更加难以防治,因此现代农业的当务之急是找到防治番茄青枯病的高效的生物防治手段。本研究针对六种苔藓样品的内生放线菌进行分离,按照分离源进行整理合并,并对其多样性进行分析;对不同形态菌株进行16S r RNA基因测序归类,并对潜在新种进行多相分类鉴定;对所有分离菌株进行抗青枯病活体外活性测试,并对活性优越的菌株进行活体内活性测试,具体内容如下:(1)选用六种培养基(AAG、CPA、DPA、GS、HV和SSA)从六种苔藓中共分离放线菌118株,其中大灰藓27株,立碗藓21株,齿边广萼苔和尖叶匍灯藓各19株,小蔓藓17株,泥炭藓15株。进一步通过形态和培养特征进行归类,合并为62株形态不同的放线菌;对这些菌株进行16S r RNA基因测序,归属为12个属,主要菌属为链霉菌属(66.1%),其它属分别为小单孢菌属(11.3%),原小单孢菌属(3.2%),红球菌属(3.2%),诺卡氏菌属(3.2%),马杜拉属(3.2%),小双孢菌属(1.6%),北里孢菌属(1.6%),分枝杆菌属(1.6%),白蚁菌属(1.6%),草孢菌属(1.6%)和微杆菌属(1.6%)。(2)通过形态特征、培养特征、生理生化特性、化学分类特征及分子分类特征,对两株菌LD120T和LD22T进行多相分类鉴定,分别鉴定为链霉菌属和马杜拉菌属的新种。LD120T命名为Streptomyces physcomitrii,LD22T命名为Actinomadura physcomitrii。(3)采用琼脂块法对62株菌进行抗青枯病活性测试,获得有抑菌活性的菌株11株,其中DD186抑制活性最强,抑菌直径可达33.00 mm。选取活性较强的4株(DC6、DD186、LD126和XG33)及新种LD120T进行了盆栽生物防治活性测试,结果显示菌株DD186防效最好,孢子浓度为1×107 CFU·g-1时防效最好可达到72.02%,LD120T也显示了较好的防效,其孢子浓度为1×107 CFU·g-1时,防效可达到63.64%,其余三株拮抗菌防效较低。(4)选取四种发酵培养基,对以上五株菌进行发酵条件优化,菌株DD186在PTM培养基中抑菌活性最强,抑菌直径可达到26.70 mm。对于DC6、LD126和XG33进行HPLC分析和活性物质追踪,显示他们产生同一种活性物质,继而选取DD186、LD120T及LD126的无菌发酵液滤液进行活体内活性测试,其中LD126的103倍发酵稀释液防效最好,可达到84.07%,其次为DD186的103倍发酵稀释液防效为67.48%,LD120T的103倍发酵稀释液防效为49.17%。(5)对DD186、LD120T和LD126活性产物进行分离,从DD186中分离到1种已知化合物为邻苯二甲酸二丁酯,LD120T中分离到3种已知化合物分别为邻苯二甲酸二丁酯、N-乙酰基酪胺及N-乙酰基酪胺类似物,LD126中分离到1种已知化合物为放线菌素D且具有抗青枯活性。本研究通过分析苔藓可培养内生放线菌多样性,为今后进一步开展苔藓植物内生菌多样性研究、资源利用以及新种研究提供基础资料;也为番茄青枯病的防治提供生防菌和抗生素,从而为番茄青枯病的生物防治奠定基础,为众多结构类型新颖的天然产物的发掘提供一定的实验参考依据。
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