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生物钟作为一种重要的调控系统,存在于生物体几乎所有的细胞中,通过调控生物钟控制基因的节律性表达来维持生物体以接近24 h为周期的各种生理功能变化。生物钟蛋白BMAL1(Brain and Muscle ARNT-like 1)属于碱性-螺旋-环-螺旋(b HLH)-PAS转录因子家族成员,是组成生物钟转录翻译正负反馈机制的核心因子,与另一个生物钟蛋白CLOCK结合形成BMAL1/CLOCK二聚体在反馈环中发挥正向调节作用。已有研究表明,Bmal1基因表达于野生型小鼠睾丸组织中,BMAL1蛋白在小鼠睾丸间质细胞中存在24 h周期节律性表达变化,Bmal1敲除小鼠血清睾酮含量显著降低,提示BMAL1在调控睾酮分泌和雄性生殖等方面发挥重要作用。此外,有证据表明血清睾酮含量在实验室大鼠、小鼠和人上均存在昼夜节律性变化。然而,作为反刍动物,山羊血清睾酮含量是否存在昼夜节律变化,生物钟基因BMAL1是否参与调控山羊睾丸间质细胞睾酮的合成,目前尚不清楚。本研究提出“BMAL1基因介导的山羊睾丸间质细胞生物钟调控睾酮合成”这一科学假说,以山羊睾丸和睾丸间质细胞为研究模型,利用Kronos AB-2550实时生物节律荧光检测系统、RT-q PCR、Western blotting、ELISA、免疫组织化学、流式细胞术、双荧光素酶报告实验等多种细胞生物学、分子生物学技术,从体内和体外水平探究生物钟基因BMAL1调控山羊睾丸间质细胞睾酮合成的分子机制。研究结果如下:1.ELISA检测结果证实山羊血清睾酮含量存在明显的昼夜节律性变化,峰值时间为ZT11.2。免疫组化结果显示BMAL1蛋白高表达于山羊睾丸间质细胞。进一步采用RTq PCR和Western blotting方法检测生物钟基因与类固醇激素合成关键酶基因m RNA和蛋白在ZT1、ZT13山羊睾丸组织中的表达差异。研究发现,BMAL1、PER2、DBP和CYP11A1m RNA表达量在ZT1和ZT13山羊睾丸组织中不存在显著性差异,而St AR、HSD3B2和HSD17B3 m RNA表达量在ZT13显著升高;BMAL1蛋白表达在ZT1和ZT13时间点无显著性差异,St AR、HSD3B2和HSD17B3蛋白表达在ZT13显著升高。由此我们推断,相对于ZT1时间点,ZT13时间点的山羊高血清睾酮含量可能与类固醇激素合成关键酶基因(St AR、HSD3B2、HSD17B3)m RNA表达的升高有关。2.进一步研究发现22R-OH-胆固醇和h CG以剂量依赖性方式促进山羊睾丸间质细胞睾酮的合成,证实了分离纯化的山羊睾丸间质细胞具有睾酮合成的生物学功能。运用RT-q PCR方法检测了生物钟基因和类固醇激素合成相关基因m RNA在地塞米松同步化后山羊睾丸间质细胞中的表达变化规律。结果表明,生物钟基因(BMAL1、PER1、PER2、DBP、NR1D1)和类固醇激素合成相关基因(SF1、NUR77、St AR、HSD3B2、CYP17A1、CYP11A1、HSD17B3)节律性表达于山羊睾丸间质细胞。使用生物节律荧光检测系统实时监测转染p LV6-BMAL1-Luc质粒的山羊睾丸间质细胞荧光素酶活性的变化规律,结果显示山羊睾丸间质细胞存在BMAL1-Luc的节律性振荡,周期为24.1±0.5h。综上所述,体外培养的山羊睾丸间质细胞存在生物钟系统的昼夜节律性振荡。3.为了探究生物钟基因BMAL1是否调控山羊睾丸间质细胞睾酮的生成,我们使用BMAL1 si RNA和BMAL1过表达质粒处理山羊睾丸间质细胞,并通过RT-q PCR、Western blotting和ELISA等技术来检测BMAL1表达的改变对山羊睾丸间质细胞类固醇激素合成相关基因表达和睾酮合成的影响。结果显示,BMAL1 si RNA不仅下调了PER2、NR1D1、DBP、SF1、NUR77、GATA4、St AR和HSD3B2基因的m RNA表达水平,而且降低了St AR及HSD3B2蛋白表达和细胞培养上清液睾酮的含量。相反,过表达BMAL1显著增加了St AR和HSD17B3的m RNA和蛋白表达水平,并提高了山羊睾丸间质细胞睾酮的生成。生物信息学分析显示,类固醇激素合成相关基因(SF1、NUR77、GATA4、DAX1、St AR、CYP17A1、CYP11A1、HSD3B2和HSD17B3)启动子区域存在生物钟基因的调控元件E-box、RORE和D-box。通过双荧光素酶报告实验进一步发现,BMAL1在转录水平上正向调控山羊HSD17B3基因的启动子活性。综上,本研究发现反刍动物山羊血清睾酮浓度存在明显的昼夜节律性变化,体外培养的经地塞米松同步化后的山羊睾丸间质细胞中也存在生物钟基因和类固醇激素合成相关基因m RNA表达的昼夜节律性变化。更重要的是,本研究证明了生物钟基因BMAL1通过调节类固醇激素合成关键酶基因(HSD17B3)的转录,从而参与山羊睾丸间质细胞睾酮的合成。本研究不仅为探究BMAL1调控反刍动物生殖内分泌功能的作用机制提供了前期理论基础,还为基于生物钟理论研发雄性生殖调控新技术提供了新思路。