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目的:卵泡是卵巢结构和功能的基本单位。根据卵泡的发育时期或生理状态,可将卵泡分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡和成熟卵泡,最终排卵。其中,初级卵泡、次级卵泡和三级卵泡被称为生长卵泡。原始卵泡发育至次级卵泡的阶段被称为腔前或非促性腺激素依赖阶段,此时卵泡的生长依赖于生殖细胞特异性转录因子的调控以及卵母细胞与颗粒细胞的物质交换与信号交流。Nobox是小鼠生殖细胞特异性表达基因,编码一个转录因子,主要表达于卵巢组织,其基因敲除小鼠显示卵巢早衰,雌鼠无生育能力。Nobox在整个卵泡发育阶段均有表达,参与原始卵泡的形成及激活。卵泡发育是连续动态的过程,生殖细胞特异性基因具有阶段性特征,目前广泛性敲除Nobox只能探究其在原始卵泡中的作用机制,其在初级卵泡及之后的作用尚未有人研究。Kit作为广泛性表达基因,在生殖细胞中也发挥着重要的作用。Kit表达于卵泡发育的所有阶段,贯穿整个卵子发生过程,影响PGCs的增殖和分化,可参与PI3K/AKT和KITL/KIT通路影响卵泡发育。在原始卵泡激活过程中,生殖细胞特异性转录因子SOHLH1可直接转录激活Kit表达,并通过PI3K/AKT通路参与原始卵泡激活。与NOBOX表达模式不同,SOHLH1只表达于卵原细胞、原始卵泡,在初级卵泡中表达逐渐消失,而在次级卵泡和其之后的阶段不再表达。当原始卵泡发育为初级卵泡后,SOHLH1表达逐渐消失,Kit仍持续大量表达,此时Kit还应受到其他转录因子调控。作为生殖细胞特异性转录因子,NOBOX在卵泡整个发育阶段均有表达,通过软件分析发现Kit启动子存在多个NOBOX结合位点,存在转录调控的可能性。此外,在初级卵泡发育至次级卵泡过程中,TGF-β/SMADs信号通路作为卵母细胞与颗粒细胞沟通的标志性通路开始调控卵泡发育。生长因子GDF9作为TGF-β超级家族的成员,在初级卵泡中开始表达,已有研究表明NOBOX可直接调控Gdf9转录,并参与GDF9/SMAD通路影响颗粒细胞增殖分化。本研究拟探索在初级卵泡发育阶段,转录因子NOBOX对Kit的转录调控作用,通过分离并体外培养初级卵泡,采用显微注射Nobox-si RNA的方法,对初级卵泡中的Nobox进行抑制,观察初级卵泡发育的变化,通过一系列分子生物学实验探究转录因子NOBOX在小鼠初级卵泡中通过Kit及GDF9/SMAD通路对卵泡发育的影响,完善转录因子NOBOX在卵泡发育过程中的作用机制。研究方法:本研究通过构建Nobox-pc DNA3.0真核表达质粒,与Nobox-si RNA共转染HEK293T细胞,验证Nobox-si RNA干扰效率;通过分离并体外培养初级卵泡,观察未注射组、注射DEPC水和注射Nobox-si RNA三组初级卵泡发育至次级卵泡的形态学变化、存活率以及三组初级卵泡发育至次级卵泡的时间;通过Real-time PCR实验检测未注射组、注射DEPC水和注射Nobox-si RNA三组初级卵泡中Nobox、Kit、Gdf9的m RNA表达变化;通过Western Blot实验检测注射DEPC水和注射Nobox-si RNA组初级卵泡中NOBOX、KIT、P-SMAD的蛋白表达变化;运用JASPAR软件对Kit基因起始位点上游（-6177bp～-5218bp和-4092bp～-2228bp）NBE位点进行预测分析;通过双荧光素酶报告基因实验分析NOBOX对Kit启动子（-6177bp～-5218bp和-4092bp～-2228bp）的转录调控作用;通过Ch IP实验验证转录因子NOBOX在Kit基因启动子上的结合位点。结果:1、Nobox-pc DNA3.0真核表达质粒构建成功,将Nobox-pc DNA3.0真核表达质粒与Nobox-si RNA共转染HEK293T细胞,转染Negative Control si RNA作为阴性对照以及DEPC水作为空白对照,检测到阴性对照与空白对照无显著性差异,且Nobox-si RNA-3干扰效率最高,抑制率为77.1%。2、通过Real-time PCR和Western Blot实验检测到初级卵泡卵母细胞中显微注射Nobox-si RNA后,与注射DEPC水组相比,初级卵泡中Nobox m RNA和蛋白表达量均下降,说明显微注射si RNA可以有效导致初级卵泡中Nobox基因沉默。3、通过分离并体外培养初级卵泡,经统计学分析,发现体外培养第5天初级卵泡可发育为次级卵泡;分离并体外培养未注射组、注射DEPC水和注射Nobox-si RNA三组初级卵泡,经统计学分析,三组卵泡存活率无统计学差异,显微注射未对初级卵泡造成影响,且未注射组、注射DEPC水2d均开始逐渐发育,第5天发育至次级卵泡;注射Nobox-si RNA组与注射DEPC水组相比:Nobox-si RNA干扰初级卵泡后,卵泡延缓2天发育至次级卵泡。4、通过Real-time PCR和Western Blot实验检测到初级卵泡卵母细胞中注射Nobox-si RNA后,与注射DEPC水组相比,初级卵泡中Kit、Gdf9 m RNA表达显著下调,KIT、P-SMAD2/3蛋白表达量降低。5、运用JASPAR软件对Kit基因起始位点上游（-6177bp～-5218bp和-4092bp～-2228bp）NBE位点进行预测分析,将5个评分较高NBE位点作为主要检测位点（-5638bp～-5634bp、-5432bp～-5425bp、-2933bp～-2926bp、-2874bp～-2867bp及-2676bp～-2669bp）;5、双荧光素酶实验结果显示,将Nobox-pc DNA3.0真核表达质粒与Kit启动子荧光表达质粒（-6177bp～-5218bp和-4092bp～-2228bp）共转染时,Kit基因起始位点上游-4092bp～-2228bp区域荧光活性显著增强,-6177bp～-5218bp区域荧光活性无显著性差异,NOBOX可在Kit基因起始位点上游-4092bp～-2228bp直接激活Kit基因的转录。6、通过Ch IP实验证明转录因子NOBOX可以结合于Kit基因转录起始位点上游（-2933bp～-2926bp）、（-2874bp～-2867bp）和（-2676bp～-2669bp）的NBE位点。结论:1、转录因子NOBOX是初级卵泡发育至次级卵泡的关键基因。2、转录因子NOBOX可与Kit基因转录起始位点上游（-2933bp～-2926bp）、（-2874bp～-2867bp）和（-2676bp～-2669bp）的NBE位点直接结合,NOBOX可直接调控Kit基因的转录水平。3、初级卵泡中Nobox基因沉默对卵母细胞与颗粒细胞间的KIT/KITL及TGF-β/SMAD通路有抑制作用。