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第一部分沉默VEGF-C基因后膀胱癌T24细胞的蛋白质组学研究目的寻找在膀胱癌T24细胞中与VEGF-C基因功能相关的蛋白,为了解VEGF-C基因在膀胱癌的作用机制提供新的思路。方法采用RNA干扰技术沉默人膀胱癌T24细胞中的VEGF-C基因,再抽提沉默组和对照组的肿瘤细胞全蛋白,利用荧光差异显示双向凝胶电泳技术获取蛋白质电泳图谱。通过对差异表达的蛋白质点定量和鉴定,筛选出与VEGF-C基因可能有相互作用的蛋白质。结果沉默组和对照组细胞之间存在25个差异蛋白质点。经质谱鉴定后,23个蛋白质点被成功鉴定。这些蛋白质包括：细胞骨架蛋白、信号转导蛋白、分子伴侣、细胞增殖和转移相关蛋白、生物合成蛋白、能量代谢蛋白等。在这23个蛋白质中,10个蛋白质在沉默组中表达上调,另外13个蛋白质沉默组中表达下调。结论联合应用RNA干扰技术和比较蛋白质组学方法,高通量筛选膀胱癌细胞中VEGF-C功能相关蛋白具有可行性。本研究发现了23个潜在的与VEGF-C功能相关的蛋白质,为进一步阐明VEGF-C促膀胱癌恶性发展的作用机制提供了新的线索和思路。第二部分maspin对膀胱癌T24细胞生物学行为的影响和机制研究目的研究maspin对膀胱癌T24细胞生物学行为的影响,并初步探讨其可能机制。方法首先通过甲基化特异性PCR法检测naspin启动子在膀胱癌T24细胞中的甲基化状态,再利用Real Time PCR和Western blotting方法观察不同浓度的5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR,0,0.25,0.5,1,2μmol/L)对naspin的mRNA和蛋白表达水平的影响。通过MTT实验观察maspin对T24细胞的增殖能力的影响,通过流式细胞仪观察maspin对T24细胞的凋亡的影响,通过迁移和侵袭实验观察maspin对T24细胞的迁移和侵袭能力的影响,并通过Western blotting方法检测Bc1-2、Bax、caspase-3p17、CyclinD1、 MMP-2、MMP-9和E-cadherin的蛋白表达水平。结果膀胱癌T24细胞可见naspin启动子甲基化DNA的扩增产物。加入不同浓度的甲基化抑制剂5-Aza-CdR后,maspin的mRNA和蛋白表达水平均呈明显增加,并具有浓度依赖性(P<0.05)；MTT实验结果证实T24细胞的增殖能力被明显抑制(P<0.05)；流式细胞仪检测发现T24细胞的凋亡明显增加(P<0.05)；细胞迁移实验和侵袭实验表明T24细胞的迁移和侵袭能力明显减弱(P<0.05)。Western blotting的结果显示CyclinD1、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平显著下降,而Bax、caspase-3p17和E-cadherin的水平则显著增高(P<0.05)。结论膀胱癌T24细胞maspin基因的启动子存在高甲基化状态。采用甲基化抑制剂5-Aza-CdR处理后,maspin的mRNA和蛋白表达水平均明显增加。maspin通过下调cyclinD1的表达,抑制T24细胞的增殖；通过上调促凋亡蛋白Bax和caspase-3p17的表达以及下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进T24细胞的凋亡；通过下调MMP-2和MMP-9的表达以及上调E-cadherin的表达,抑制T24细胞的迁移和侵袭能力。第三部分maspin与VEGF-C在膀胱癌中的表达及相关性研究目的研究膀胱癌标本中maspin蛋白与VEGF-C蛋白表达的关系,并通过体外实验进一步验证。方法采用免疫组化的方法研究53例膀胱癌患者的手术标本中VEGF-C蛋白和maspin蛋白的表达情况,并检验两者的相关性。采用Western blotting方法检测不同浓度的VEGF-C (0,50,100,200ng/mL)对maspin蛋白在T24细胞中的表达的影响。通过不同浓度的5-Aza-CdR(0,0.25,0.5,1,2μmol/L)激活naspin的表达,再采用Western blotting方法观察maspin对T24细胞中VEGF-C蛋白表达的影响,进一步在体外实验探讨其相关性。结果VEGF-C蛋白在膀胱癌组织中的表达显著高于正常组织,而maspin蛋白的表达在膀胱癌组织中的表达则显著低于正常组织。53例膀胱癌标本的maspin蛋白与VEGF-C蛋白表达都与膀胱癌的临床分期、病理分级和淋巴结转移相关(P<0.05),与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤个数和发病次数均无明显相关(P>0.05)。maspin的表达与VEGF-C的表达呈负性相关,相关系数为-0.589(P<0.001)。VEGF-C作用于T24细胞后,maspin蛋白的表达明显下降；而当rmaspin蛋白的表达被激活后,VEGF-C蛋白的表达也显著减少。这两种效应均具有浓度依赖性(P<0.05)。结论VEGF-C蛋白在膀胱癌组织中的表达显著高于正常膀胱组织,而maspin蛋白在膀胱癌组织中的表达则显著低于正常膀胱组织。maspin和VEGF-C蛋白都与膀胱癌的临床分期、分级和淋巴结转移的发生率具有统计学意义的关联,对膀胱癌的诊断和治疗具有重要的临床意义。maspin和VEGF-C在膀胱癌中的表达呈负性相关,两者之间的相互调控可能在膀胱癌的发展过程中起着重要作用。