论文部分内容阅读
目的：我们在前期工作中已证实,羊膜间充质干细胞(amniotic mesenchymal stem cells,AMSC)体外具有与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)相似的支持造血作用,甚至表达比BMSC更丰富的造血细胞因子。与羊膜上皮细胞(amniotic epithelial cells,AEC)共培养可以有效增加AMSC表面CXCR4的表达,并保持良好的细胞活性。我们推测可能与AEC和AMSC共培养产生的多种细胞因子的作用有关。但由于AMSC与AEC共培养成本高、操作较复杂、难以满足临床治疗所需大量细胞,在临床上应用中受到限制。而条件培养基具有成本低,方法简便、可冻存备用等优点。故本研究拟通过采用AEC条件培养基培养AMSC,观察AMSC生物学特性的变化,并与前期的共培养作比较,探索条件培养基培养的可行性；同时检测培养中细胞因子分泌的变化,探讨细胞因子对CXCR4表达变化的影响；最后将AEC条件培养基培养后的AMSC输入亚致死剂量照射后的NOD/SCID小鼠体内,观察其短期归巢能力的变化,探讨SDF-1/CXCR4轴在AMSC的归巢、迁移过程中的作用。拟为AMSC应用于临床奠定理论基础,也希望为临床提高MSC移植疗效提供实验依据。方法：分别采用组织块法和消化法从羊膜中分离、培养AMSC和AEC,建立条件培养体系。实验分组为条件培养组、血清培养组(即常规培养组)、无血清培养组。应用台盼蓝染色法及MTT法观察条件培养48h对AMSC细胞活力的影响；采用流式免疫分析检测AMSC表面CXCR4及IL-6受体的表达；同时检测培养中多种细胞因子(IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12P70)的含量；结合millicell小室探索条件培养基培养对AMSC体外迁移能力的影响；最后将条件培养组与血清培养组AMSC行PKH26染色后输入NOD/SCID小鼠体内,24h后处死小鼠,取受体小鼠的骨髓,用流式细胞仪分析其中PKH26+供体细胞的数量。结果：1、培养48h后,条件培养组与血清培养组AMSC存活率均高于无血清组。2、条件培养组与血清培养组的增殖活性均高于无血清培养组。3、条件培养组与无血清培养组细胞表面的CXCR4及IL-6受体(CD126)的表达均高于血清培养组。4、用中和抗体封闭IL-6后,条件培养组AMSC表面CXCR4及IL-6受体表达均下降。5、与前期AEC共培养相比,AEC条件培养基培养对AMSC的生物学特性的影响并无明显差异。6、通过流式免疫分析检测培养上清液中细胞因子发现,IL-8、IL-6、IL-1p的分泌量均高,尤以IL-8、IL-6显著。7、AMSC体外能够沿SDF-1浓度梯度趋化迁移,条件培养组的AMSC迁移数高于血清培养组。8、AMSC移植入受体小鼠后,条件培养组较血清培养组归巢至小鼠骨髓的细胞数量增加,用CXCR4的中和抗体预先孵育后,AMSC归巢数量明显减少。结论：1、AEC条件培养基培养AMSC在保持其增殖活性的同时,能有效上调细胞表面CXCR4及IL-6受体(CD126)的表达。2、在AEC条件培养基上调AMSC表面CXCR4的表达中,IL-6等细胞因子及其受体可能起了重要作用。3、AEC条件培养基培养,在体外增强了AMSC沿SDF-1浓度梯度迁移的能力,并增强体内短期归巢至骨髓的细胞数量。4、在AMSC向骨髓归巢过程中,SDF/CXCR4轴起重要作用。