【摘 要】
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我国于1992年首次发现H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）,此后的20多年该病毒持续存在,并且逐渐成为我国流行率最高的禽流感亚型。H9N2亚型禽流感虽然为低致病性禽流感,但感染后会引起禽鸟产蛋下降以及呼吸道症状,并且经常容易发生继发感染,加重发病率和死淘率,对养禽业造成巨大的经济损失。为了解2019～2020年我国部分地区H9N2亚型AIV的抗原变异情况,
【基金项目】
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十四五国家重点研发计划（2021YFD1800201）
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我国于1992年首次发现H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）,此后的20多年该病毒持续存在,并且逐渐成为我国流行率最高的禽流感亚型。H9N2亚型禽流感虽然为低致病性禽流感,但感染后会引起禽鸟产蛋下降以及呼吸道症状,并且经常容易发生继发感染,加重发病率和死淘率,对养禽业造成巨大的经济损失。为了解2019～2020年我国部分地区H9N2亚型AIV的抗原变异情况,本研究对本实验室自2019～2020年分离的我国部分地区的1152株H9N2亚型AIV进行分子流行病学调查,研究毒株的进化变异情况;利用血清学试验技术对挑选毒株进行抗原性分析后挑选了疫苗候选株,并对疫苗候选株的免疫效力做出评价。1.H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学调查对2019～2020年我国部分地区分离到的H9N2亚型AIV测序并对其遗传进化特点进行分析,结果显示,所有病毒均属于h9.4.2亚系,分离株在系统发育树上分布比较集中,均同属于h9.4.2.5进化分支,但已经形成多个单独的进化分支。除3株病毒外,其余毒株的HA蛋白都有Q226L的突变,有潜在感染人类的风险。NA蛋白根据是否发生颈部氨基酸的缺失,明显分为两个类型,由于颈部缺失,会导致NA蛋白的61位氨基酸的潜在糖基化位点缺失,颈部缺失的毒株与Y280-Like毒株的潜在糖基化位点类型一致,颈部没有缺失的毒株与A/Duck/Hong Kong/Y439/97（H9N2）毒株的潜在糖基化位点类型一致。在分析的1152株病毒中,有8株病毒存在第61位潜在糖基化位点。对11株代表毒株的内部基因测序分析后,3株病毒与其他8株病毒的遗传距离较远,属于单独的分支,且与其他亚型（H10N3、H7N9、H10N8）相似度更高,H9N2的内部基因可作为其他亚型内部基因的供体,如H7N9,可引起严重的呼吸道疾病。2.H9N2亚型禽流感病毒抗原性分析通过氨基酸同源性比对及遗传进化分析,挑选9株病毒对其抗原性进行分析。9个毒株免疫鸡群后,抗体水平普遍较高（抗体效价≥8log2）,具有良好的免疫原性;中和试验结果显示,毒株H2049和J1443两个毒株只对自身和互相产生较高的保护力,而对其他毒株保护力较低,并且H2049、J1443毒株与其他毒株间的R值都较小,表示抗原之间抗原性差异大。综合交叉血凝抑制试验和中和试验的结果,证明存在两个抗原群。我们根据交叉血凝抑制试验和中和试验的结果,选择抗原性好,遗传稳定的一株毒毒株Y2432作为疫苗候选株免疫鸡群,21 d后用两个抗原群的病毒去攻击鸡群,鸡群均未排毒,证明该疫苗可以完全保护鸡群。制备的候选灭活疫苗免疫SPF鸡连续监测20周,观察抗体消长规律,14d即可产生高水平抗体,最高平均抗体可达到14.4 log2,且抗体可维持140 d以上。利用反向遗传技术成功拯救一株病毒Re-Y2432,比较亲本毒与重组毒的异同,结果显示重组毒与亲本毒HI相差不超过1 log2,差距较小。MDT结果表明,重组病毒对鸡胚致死力低于野毒。重组病毒的构建为后续分子定点研究搭建平台,也为新型H9N2亚型禽流感疫苗提供思路。
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