植物花粉发育是一个复杂而高度程序化的过程,该过程受到许多基因的调控,这些基因按照表达时间的先后被分为早期发育基因和晚期发育基因。晚期发育基因通常在花粉成熟、花粉萌发及花粉管生长过程中起作用。本实验室从棉花的花cDNA文库(flower cDNA library)筛选出了两个花粉特异性基因(GhPSP231和GhMYB24),本论文对其表达和功能进行了研究,获得的主要研究结果如下：1. GhPSP231基因是棉花花粉特异性基因。利用Northern杂交、Real-time RT-PCR及原位杂交技术在mRNA水平上检测GhPSP231的组织表达模式,结果显示该基因只在单核期以后的花粉中高度表达,而且,随着花粉发育成熟,该基因表达量不断上升。利用该蛋白特异性抗体进行Western blot及免疫组织化学实验在蛋白水平上检钡GhPSP231的表达模式,结果显示该蛋白是单核期之后花粉特异蛋白,随着花粉发育成熟,其蛋白含量也不断增多。这说明该基因是花粉特异性基因,可能参与花粉成熟与花粉管萌发等过程的调节。2. GhPSP231启动子活性及功能调控元件分析。我们分离了1.2kb GhPSP231启动子(GHPSP231P)序列,构建了PBI-GhPSP231P::GUS融合表达载体,并通过叶盘法转化烟草,对获得的转基因植株进行GUS活性染色,结果显示GUS基因只在单核期以后的花粉中及萌发的花粉管中表达,而在其他组织中均不表达,J且GUS信号强度与花粉发育时期相关。上述结果说明该启动子仅在处于单核期以后的花粉中具有表达活性。为了研究GHPSP231启动子中花粉特异性活性区域,我们将启动子从5’端开始作不同长度的截短,得到一系列长度的启动子片段(GhPSP231Pl-GhPSP231P5),并分别构建到PBI101载体上,转化烟草后进行GUS活性分析。结果显示,启动子长度截短到只剩446bp (GhPSP231P4)时,仍能启动GUS基因在花粉细胞中特异性表达,但当启动子长度截短到只剩下241bp(GhPSP231P5)时,启动子活性丧失。说明GhPSP231基因起始密码子上游-446bp至-241bp的区间是维持其花粉特异性启动子活性的重要区域。3. GhPSP231在裂殖酵母细胞生长和分裂中的作用。利用克隆重组技术构建了该基因的裂殖酵母诱导表达载体pREP5N-GhPSP231,导入裂殖酵母细胞中,并诱导该基因表达在酵母细胞内表达。观察结果显示,在诱导表达GhPSP231蛋白后,酵母细胞中发生了初生隔膜过度增厚及胼胝质的异位沉积吧,抑制了酵母细胞的胞质分裂,致使大量(约50%)酵母细胞停留在有丝分裂末期,从而抑制酵母细胞的更新繁殖,使得酵母细胞发生死亡。4.过量表达GhPSP231引起烟草花粉发育异常。为了研究该基因在花药发育中的功能,我们构建了由该基因启动子启动的该基因过量表达载体,转化烟草,共获得6个株系的转基因植株,并从中选取3个GhPSP231表达量不同的株系进行后续研究。除了表达量较高的一个株系外,其他株系的结实率基本正常,与野生型没有显著差异。但进一步对其花粉进行观察显示,GhPSP231过量表达导致成熟花药中出现许多体积小且畸形的花粉粒。FDA/PI染色结果表明这些异常的花粉粒缺乏生活力。花粉体外萌发实验结果证实该基因过量表达会严重影响其花粉萌发与花粉管生长。花粉的DAPI染色结果表明过量表达该基因在一定程度上影响了小孢子发育过程中的细胞不均等分裂。5.抑制GhPSP231基因表达导致转基因棉花高度雄性不育。构建了GhPSP231的RAN干扰(RNAi)载体,转化棉花,获得大量转基因棉花植株。比较观察RNAi植株与野生型植株的差异,结果显示GhPSP231的转基因棉花的营养生长和野生型差异不大,但都呈现高度不育的现象。进一步观察其花器官,发现在转基因植株中花药均不开裂。将开花的转基因植株花粉分离出来,进行原位萌发实验,结果显示绝大多数转基因植株花粉不能在柱头形成花粉管。花药半薄切片观察显示转基因植株和野生型一样,花药壁结构基本正常,也都能形成正常的单核小孢子,但转基因植株花粉发育停滞在小孢子液泡化时期,不能形成成熟花粉粒。6. GhMYB24基因的分离鉴定及功能研究。从棉花中分离得到了一个编码210个氨基酸残基的R2R3型MYB蛋白的基因,命名为GhMYB24。GhMYB24蛋白定位于细胞核并具有转录激活活性,推测其为转录激活型转录因子。我们通过Northern杂交检测该基因的组织表达模式,结果显示该基因是花药优势性表达基因。进一步通过原位杂交实验发现,该基因的表达主要集中在花粉中,且其表达强度受到花药发育的调控。在拟南芥中过量表达GhMYB24基因会引起花畸形、花丝变短、花药不开裂和花粉活性下降等表型。半薄切片观察过量表达GhMYB24基因的转基因拟南芥花药结构,发现转基因植株中花药存在隔膜不退化、气孔不开裂和药室内壁中纤维带减少等表型。RT-PCR结果显示在GhMYB24过量表达的拟南芥花中,一些参与苯丙烷类次生代谢和活性氧平衡的基因的表达量发生改变。此外,一些参与茉莉酸生物合成及信号传导通路的基因的表达量在GhMYB24转基因植物中都发生了上调。酵母双杂交实验结果表明,GhMYB24能够与GhJAZ1和GhJAZ2F发生相互作用。上述实验结果表明,GhMYB24可能对正常的花药/花粉发育起着至关重要的作用。