杆菌肽是由11种氨基酸组成的一种环肽类抗生素,其具有抑菌性强、安全性高、稳定性好等特点,因而在饲料添加剂领域具有十分广阔的应用前景。之前的研究表明,低水平的前体氨基酸供给是限制杆菌肽生物合成的重要因素,而支链氨基酸作为杆菌肽的重要组分,菌株合成支链氨基酸能力的提高有利于杆菌肽高效合成。本研究通过基因工程手段对地衣芽胞杆菌DW2支链氨基酸的合成途径、转运蛋白及转录调控因子进行系统改造来提高胞内支链氨基酸的浓度,为杆菌肽的高产提供了一种新策略。本研究以地衣芽胞杆菌DW2为出发菌株,通过基因工程手段对支链氨基酸合成途径的一系列基因进行游离过表达,发现乙酰乳酸合酶基因ilv B、2-异丙基苹果酸合酶基因leu A和转氨酶基因ybg E游离过表达的效果优于携带对照质粒菌株;为了消除游离质粒对菌体生长的不利影响,采用基因整合或强启动子替换的方法分别对leu A、ilv B和ybg E进行强化表达,其杆菌肽效价与DW2相比分别提高了11.67%、10.50%和8.62%。随后,检测了leu A、ilv B和ybg E强化表达工程菌在杆菌肽快速合成时期胞内外支链氨基酸的浓度,发现整合强化表达leu A后,胞内L-亮氨酸浓度提高了183.20%,而L-异亮氨酸和L-缬氨酸的浓度没有明显变化;用启动子替换的方法强化表达ilv B和ybg E后,胞内三种BCAAs的浓度相比DW2均显著上升,其中L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸浓度分别提高138.96%、28.07%、142.35%和89.40%、25.81%和102.66%。BraB、BrnQ和YvbW是DW2中注释的三种支链氨基酸转运蛋白,其具体功能尚未有研究报道。本研究构建了不同表达水平的BraB、BrnQ和YvbW相关工程菌,其杆菌肽发酵结果表明,用启动子替换的方法强化表达转运蛋白基因bra B、brn Q和yvb W分别将杆菌肽效价提高了10.26%、7.10%和5.39%。随后,检测了bra B、brn Q和yvb W强化表达工程菌在杆菌肽快速合成时期胞内外支链氨基酸的浓度,发现三株工程菌胞内的支链氨基酸浓度均显著提高,其中brn Q强化表达提升的幅度最大。Lrp作为一种在细菌中广泛存在的转录调控因子,能调控包括氨基酸代谢及抗生素合成在内的众多生理过程。本研究发现,在DW2中缺失lrp后,杆菌肽效价提高了12.60%。随后,分别检测了lrp缺失菌株DW2△lrp和DW2在杆菌肽大量合成时期的胞内外氨基酸浓度。结果表明,lrp缺失后,L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸浓度与DW2相比分别提高了148.05%、20.03%和144.94%,而杆菌肽的其他组成氨基酸浓度无明显差别。此外,分别检测了DW2△lrp和DW2在发酵20 h（杆菌肽合成早期）支链氨基酸合成和转运等相关基因转录水平,发现DW2△lrp中brn Q的转录水平较DW2提高了2.82倍,其余基因的转录水平则无明显变化,说明lrp的缺失提高了brn Q的表达水平,使更多的支链氨基酸转运至胞内,从而促进了杆菌肽的合成。最后,本研究将前面研究得到效果较好的基因在DW2中进行叠加敲除或强化表达,成功获得杆菌肽高产菌株DW08,其杆菌肽产量与DW2相比提高了40.93%,同时胞内支链氨基酸的浓度也显著提高。本研究结果表明,强化细胞内前体氨基酸供给水平是提高杆菌肽产量的有效策略。