免疫球蛋白是一类具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。1968年命名为Imunoglobulin，简称Ig，普遍存在于哺乳动物的血液、组织液、淋巴液及外分泌液中。免疫球蛋白在动物体内具有重要的免疫和生理调节作用，是动物体内免疫系统最为关键的组成物质之一。IgG是血清中浓度最大的一类免疫球蛋白，占免疫球蛋白含量的70～80％，在抗体介导的防御反应中起主要作用。在人工自动免疫和自然免疫感染后，机体所产生的抗体主要是IgG，它不仅含量多，而且持续时间也长，是抗感染免疫的主力，具有抗菌、抗病毒和抗外毒素等多种活性。 1993年以来，我国肉类产量一直处于世界第一位，生猪产量接近世界总产量的一半。从产血量来看，牛的总出血量为活牛重的4.2％，猪为3.5％,羊为3.2％。目前我国的动物血液总产量超过1.2×10<5>t，其蛋白质含量几乎相当于北京地区当年肉类蛋白质总量的5倍，但利用率很低，资源浪费十分严重，其中主要都用做简单的血制品食用、饲料或作为废料弃去，其中所含的免疫球蛋白等丰富的活性物质则随之白白的流失，动物性副产品已经成为目前国际上动物性食品加工中等待解决的重要难题，它不仅造成其中有利用价值的物质的浪费，也是主要的污染源之一。因此对畜禽血液的加工与开发利用既是对污染问题的很好的解决，也是开发新资源、变废为宝、提高产品附加值的重要举措。而且也能较有效的解决党中央提出的“三农”问题。而本实验中免疫血清的制备，正是以这些废弃的血液为原料进行生产利用的，所以有着巨大而深远的意义。 牛血清和牛初乳中免疫球蛋白的含量较多，尤其是经过免疫强化注射的牛可生产出富含免疫球蛋白的血液，是工业化生产免疫球蛋白的极好原料来源。因此，以牛血液作为提取免疫球蛋白的原料具有充分的理论依据，将牛血液免疫球蛋白以添加剂形式应用于食品及饲料生产有着广泛的前景和意义。从长远发展来看，免疫血清作为一种新型添加剂在我国及国际一定会有良好的发展前景。 本论文对不同生理状况下牛血清中免疫球蛋白(IgG)含量进行了普查，并以2株人体肠道病原菌(沙门氏菌50333、50071)作为抗原制作疫苗，对牛进行人工免疫，提取、分离和纯化特异性免疫球蛋白。该免疫球蛋白对热、酸碱及胃肠道消化液具有不问的抗性，并且可以在体内、体外对相应的抗原作出免疫应答。实验对IgG进行了微胶囊包埋保护研究，并在酸奶中的应用进行了初步探讨。研究结果如下： 1．不同生理状况下牛血清中IgG含量有所不同，2～8岁成年牛血清中IgG含量为10～11mg/mL，之后逐渐下降。小于6岁牛龄和大于8岁牛龄的公牛与母牛之间血液中免疫球蛋白含量没有显著差异，6～8岁牛龄之间的母牛血液免疫球蛋白含量高于公牛。 2．产后仔牛前2天由于母牛初乳中IgG较高，所以血清中IgG的含量也非常高，之后IgG含量逐渐下降。牛初乳中IgG含量在泌乳第18小时达到峰值；母牛血清IgG含量基本保持不变。但是仔牛血清中的IgG含量在摄食初乳前，血清中IgG含量非常低，摄食初乳后IgG很快提高，至24小时达到峰值，其后的12小时一直保持比较高的水平。因此建议提取牛血液中免疫球蛋白应选择8年以下牛龄的血液为原料。 3．本实验通过以2株人肠道病原菌病原菌(包括沙门氏菌50333、50071)作为抗原制作疫苗，按有关标准进行物理性质及无菌检验，均符合要求，可以用该疫苗对试验牛进行人工免疫；免疫结果显示在免疫前后免疫血清和非免疫血清中IgG含量无显著变化，免疫组的IgG含量在免疫中期略有上升，但不是很显著； 4．通过ELISA法测定IgG的抗体效价，在免疫前后变化显著，50333在42天时0.D值达到1.20，50071在42天时0.D值达到1.18；免疫2个剂量组的0.D值略高于免疫1个剂量组的0.D值。但考虑到成本等原因，最后确定1个剂量为最佳免疫剂量。 5．选取饱和硫酸铵、辛酸-硫酸铵、饱和硫酸钠三种盐析方法，对牛血清中的免疫球蛋白进行分离提取，得到免疫球蛋白的粗提物。通过比较三种方法的提取得率和产品回收率确定采用饱和硫酸铵沉淀法提取效果最佳，提取得率为9.06mg/mL，产品回收率为91％。试验通过进行单因素试验、响应面分析试验，得出适合饱和硫酸铵法的最佳试验方案，经过验证试验确定试验条件如下：提取温度为50℃、静置时间为30min、血清-PBS溶液比例为2：1、缓冲溶液pH值7.4。 6．试验利用超滤法提取免疫牛血清中的特异性免疫球蛋白IgG，通过比较单段间歇操作、间歇式重过滤、连续式重过滤等3种超滤方式，表明单段间歇操作将原体积浓缩到1/5之后，总蛋白质浓度提高了2.78倍，免疫球蛋白浓度提高了2.90倍，且活性没有变化，IgG截留率为100％，但纯度较低。间断式稀释超滤是最佳的超滤方式，随着稀释次数的增加， IgG的纯度逐渐提高，经一次稀释超滤即可达到78.31％。通过研究超滤的操作单因素对IgG/蛋白质及IgG活性的影响结果表明，随着时间的延长IgG纯度逐渐下降，随着操作压力和温度的升高而升高；在超滤过程中IgG的活性随着温度和操作压力的上升而逐渐下降，料液浓度对IgG的活性无明显影响。最终确定应用中空纤维膜分离牛血清中的IgG的最适操作条件是温度30℃，操作压力0.10Mpa，血清稀释8倍，IgG纯度达到80.52％。纯化研究结果表明，在pH值7.2时，随着PBS溶液浓度的提高，所得的IgG相对纯度逐渐降低，但IgG含量增加，同时有少量杂蛋白出现；用0.1mol/L，pH值7.2的PBS溶液洗脱的DEAE-52柱层析洗脱液浓缩后，上Sephadex-G200凝胶层析柱，可得到纯度达99％的IgG纯品。经鉴定，所提IgG的分子量约为157KD。 7．对IgG的稳定性研究表明，IgG在0～65℃下稳定，当温度超过75℃很快失去活性，温度越高失活的比例越大。牛血清IgG在pH值<4.0或pH值>10.0时，不稳定，pH值在4.0～10.0IgG较为稳定。 8．IgG在消化系统中的稳定性主要受二个因素的影响，一个是胃酸，另一个是肠道中的胰蛋白酶，在这二个因素中，胃酸造成的变性较胰蛋白酶的水解对IgG活性的影响更大。相对而言，胃蛋白酶对IgG的水解尽管影响其分子结构的完整性，但不影响其抗原的结合活性；在肠道中，胰蛋白酶对IgG活性影响很小。胃蛋白酶和胰蛋白酶浓度越高，对IgG的破坏越严重，pH值越大IgG的变性程度越大。工gG提取物及添加于乳粉中的IgG在室温和37℃下存放三个月，具有很高的稳定性，因此，IgG或添加工gG的制品完全可以在室温下存放而不必冷藏。 9．本研究分别用沙门氏菌50333和50071培养液做抗原，用相应的IgG做抗体进行体外免疫试验，证明具有明显的抗原抗体凝集反应。 动物试验表明，竟口喂食血清特异性IgG对沙门氏菌所致的小鼠腹泻具有保护作用，小鼠在攻毒后12小时内腹泻率为3％，到24小时95％恢复正常。 10．利用乳化缩聚法制备的IgG微胶囊约有80％的粒径小于60μm，大部分集中在20～40 μ m之间。IgG微胶囊的体外释放特性研究表明：IgG微胶囊在pH7.4的PBS中释放速度比较慢，在人工肠液中的释放速度比较快。IgG微胶囊化后可明显提高热稳定性，在70℃15min变性率仅为19.4％。微胶囊化的IgG可以明显提高IgG在消化系统中的稳定性，在人工胃液中的表观回收率为75.8％，在人工肠液中的表观回收率为90.1％，可以有效地抑制胃酸的破坏作用，并可降低蛋白酶对IgG的分解作用。 11．用未经微胶囊化的IgG制备酸奶，在刚凝固好的酸奶中可检测到少量的残余IgG，而存放24h后，则IgG全部失活；而用微胶囊化的IgG制备的酸奶，在刚制备好的酸奶中表观回收率达89.4％，存放24h后表观回收率为80.7％。这说明微胶囊化的IgG在食品加工过程中可以大大提高IgG的抗酸、抗热的能力。