卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤首位。临床上卵巢癌治疗手段以肿瘤细胞减灭术为主,辅助化学治疗。尽管卵巢癌治疗方案明确,手术设备也日臻完善,化疗药物层出不穷,但晚期卵巢癌的五年生存率仍然仅有20%-30%。导致低存活率主要有两点原因:(1)卵巢癌发现时期别已较晚,多伴有其它部位转移,难以实施理想的肿瘤细胞减灭术;(2)化疗产生严重毒、副作用,如骨髓抑制,肝、肾功能损伤等,导致患者难以按规定的疗程和剂量完成化疗。因此,寻找到一种有效抑制卵巢癌,同时还能对脏器功能有保护作用的药物,成为科研人员研究的重点。尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)是一种丝氨酸蛋白酶,uPA通过其生长因子结构域(GFD区)与细胞表面的尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)高效结合后,激活纤溶系统,降解细胞外基质及基底膜,促进肿瘤血管生成,激活MAPK,Src,FAK,PI3K-AKT等信号通路,在肿瘤的增殖、转移中起重要作用。uPA与uPAR在包括卵巢癌在内的多种实体肿瘤中高表达,且其表达水平与患者的预后密切相关。Kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI)是一类对丝氨酸蛋白酶有抑制作用的酶。其对uPA/uPAR系统中uPA功能可产生抑制作用,进而能够抑制uPA/uPAR系统在肿瘤生长和转移中的作用。另一方面,Kunitz型蛋白酶抑制剂能抑制炎性介质的释放,抑制白细胞过度激活;抑制超氧阴离子自由基产生,降低脂质过氧化损伤;稳定溶酶体膜,抑制溶酶体的降解作用;抑制Ca2+激活的K+离子通道,延迟细胞凋亡和死亡。KPI在抗肿瘤转移和器官保护方面的研究日渐增多。基于上述KPI和uPA/uPAR系统的关联以及各自的功能作用。本研究团队前期以uPA的GFD区连接一种从人β-淀粉样肽中获得的KPI结构域,重组制备了新型人源Kunitz融合蛋白uPAg-KPI。拟在本研究中探索uPAg-KPI在抗卵巢癌和器官保护中的作用。目的:验证uPAg-KPI在体内和体外实验中对卵巢癌增殖和转移的抑制作用,以及其对增殖、转移相关通路的影响;验证uPAg-KPI在肝、肾损伤模型中对肝、肾功能的保护作用,以及其对氧化平衡系统的影响。方法:(1)通过MTT,克隆形成试验,流式细胞术,Transwell试验,划痕试验,探讨uPAg-KPI对SKOV3的生长和转移的抑制作用。通过Western Blot初步探讨其作用机制。(2)通过构建人卵巢癌SKOV3细胞的裸鼠移植瘤模型,对比裸鼠移植瘤大小和重量,比较抑瘤率,探讨uPAg-KPI在体内对卵巢癌的抑制作用及在联合应用中的辅助作用。通过免疫组化法检测P-ERK、P-AKT、PCNA、VEGF这些与生长转移有关蛋白,初步探讨机制。(3)构建顺铂致小鼠急性肾损伤模型,通过对比小鼠生长状态,肾BUN、CRE水平,行肾脏组织病理学检查的方法,探讨uPAg-KPI在急性肾损伤中的保护作用;通过检测肾脏匀浆组织中MDA、SOD、GSH-PX、CAT含量,初步探讨作用机制。(4)构建CCl4致小鼠急性肝损伤模型,通过对比小鼠生长状态,肝ALT、AST水平,行肝组织病理学检查的方法,探讨uPAg-KPI在急性肝损伤中的保护作用;通过检测肝脏匀浆组织中MDA、SOD、GSH-PX、CAT含量,初步探讨作用机制。结果:(1)uPAg-KPI抗卵巢癌作用的体外实验,(1)uPAg-KPI对SKOV3的抑制作用呈现时间和浓度依赖性,在uPAg-KPI浓度为0.5μg/μl,药物作用48h时可抑制率可达50%。(2)uPAg-KPI组(0.5μg/μl)克隆形成数目为12%±0.76%,与对照组18%±2.18%比较,显著降低。(3)流式细胞术检测uPAg-KPI用药后细胞周期的分布,加药组G1期细胞增加,S和G2/M期细胞百分比下降,细胞周期阻滞于分裂期之前。(4)划痕实验中uPAg-KPI组划痕区域细胞数量较对照组明显降低。(5)Transwell迁移实验中,uPAg-KPI组穿膜细胞数12.5±5.06,较对照组37.7±6.34显著降低;Transwell侵袭实验中,uPAg-KPI组穿膜细胞数5.5±2.46,较对照组为24.4±3.20显著降低。(6)Western blot检测uPAg-KPI与SKOV3细胞作用12、24、48小时后,ERK1/2,P-ERK1/2和AKT和P-AKT水平,总ERK1/2和总AKT蛋白的表达无明显变化,p-ERK1/2和p-AKT表达水平下调。(2)uPAg-KPI抗卵巢癌作用的体内实验中:(1)uPAg-KPI组裸鼠移植瘤的大小和重量均小于对照组。(2)比较三组用药组抑瘤率,联合用药组高于顺铂组高于uPAg-KPI组(71.69%>45.14%>33.32%)。(3)在裸鼠终体重和生长状态观察对比中,顺铂组、顺铂联合uPAg-KPI组与对照组比,体重下降明显,以顺铂组为著;裸鼠生长状态观察中,顺铂及顺铂联合uPAg-KPI组裸鼠生长状态较差,uPAg-KPI组裸鼠一般状态未受影响。(4)uPAg-KPI组与对照组的免疫组化结果比较,uPAg-KPI组P-ERK、P-AKT、PCNA、VEGF蛋白表达降低。(3)uPAg-KPI对顺铂所致小鼠急性肾损伤的保护作用:(1)顺铂致小鼠急性肾损伤模型中,模型组与对照组比较,血清CRE、BUN显著升高,肾功能受损,造模成功。(2)在三组不同剂量的uPAg-KPI用药组中,血清CRE与模型组均数明显降低,但并无统计学意义。大剂量uPAg-KPI组血清BUN较模型组明显降低,差异有统计学意义。(3)小鼠肾组织匀浆检测MDA、SOD、CAT、GSH-PX水平,uPAg-KPI各剂量组MDA含量均较模型组降低;SOD检测中,大剂量uPAg-KPI组中SOD含量较模型组升高;CAT检测中,各剂量组uPAg-KPI组中CAT含量较模型组升高;GSH-PX含量检测中,中剂量和大剂量uPAg-KPI组中GSH-PX含量较模型组升高。上述差异均有统计学意义。(4)肾脏组织HE染色后观察,uPAg-KPI可降低造模后肾脏炎症反应,管型减少,肾小管上皮细胞脱落、肿胀减轻。(4)uPAg-KPI对CCl4所致小鼠急性肝损伤的保护作用:(1)CCl4致小鼠急性肝损伤模型中,模型组与对照组比较,血清ALT,AST显著升高,肝功能受损,造模成功。(2)在三组不同剂量的uPAg-KPI用药组中,大剂量uPAg-KPI组ALT与模型组比较,明显降低;AST结果中,中剂量和大剂量组较模型组AST降低,差异均有统计学意义。(3)小鼠肝组织匀浆检测MDA、SOD、CAT、GSH-PX水平,uPAg-KPI各剂量组MDA含量均较模型组降低;在SOD检测中,中剂量和大剂量uPAg-KPI组中SOD含量较模型组升高;CAT检测中,中剂量和大剂量uPAg-KPI组中CAT含量较模型组升高;GSH-PX含量检测中,中剂量和大剂量uPAg-KPI组中GSH-PX含量较模型组升高。上述差异均有统计学意义。(4)肝脏HE染色后观察,uPAg-KPI可降低造模后肝脏炎症反应,空泡变性和脂肪变减少,肝小叶结构变清晰、规则。结论:(1)uPAg-KPI对卵巢癌SKOV3细胞的增殖、侵袭、转移有抑制作用,该作用可能与阻滞细胞周期,干扰P-ERK、P-AKT相关信号通路有关。(2)uPAg-KPI对卵巢癌的体内实验有抑制作用,在与顺铂联合使用时,抑制作用增强。uPAg-KPI的抑制作用可能与下调P-ERK、P-AKT、PCNA、VEGF蛋白表达有关。uPAg-KPI与顺铂联合应用时,可能会改善顺铂毒、副作用。(3)uPAg-KPI能够改善顺铂所致的急性肾功能损伤,降低顺铂引起的肾小管扩张,蛋白管型的形成,炎细胞浸润和上皮细胞变性坏死。该保护功能与抗自由基损伤,降低脂质过氧化产物形成有关。(4)uPAg-KPI能够改善CCl4所致的急性肝功能损伤,降低CCl4引起的肝脏炎细胞浸润,肝细胞的变性、坏死。该保护功能与抗自由基损伤,降低脂质过氧化产物形成有关。