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[背景和目的]随着经济飞速发展和信息全球化进程加快,全球毒品问题不断泛滥蔓延,吸毒人员数目不断增加,并且在我国吸食冰毒人数已经超过吸食传统毒品海洛因人数,目前冰毒已经成为我国的“头号毒品”。长期吸食冰毒将导致全身各个器官及系统损伤,但是因其损伤机制不明确导致冰毒戒治方法缺乏合理性及有效性,所以新的冰毒损伤机制研究亟需处理。甲基苯丙胺(Methamphatamine,METH),冰毒(ICE)主要成分,吸食后主要能够快速通过血-脑屏障,作用于中枢神经系统,产生幻想、妄想、活动偏执、甚至自杀倾向等不良生理心理反应,其次也能够作用通过机体循环作用于外周神经系统、心血管、消化系统等其他组织、器官和系统,产生急慢性毒性反应和严重的损伤作用。目前甲基苯丙胺损伤机制研究主要集中于神经系统,但是数例临床病案报道甲基苯丙胺能导致消化道溃疡、坏死、穿孔等肠道炎性损伤作用,并且甲基苯丙胺致消化系统损伤机制,特别是肠道组织,缺乏系统的实验研究,因此我们设计实验弥补甲基苯丙胺致肠道炎损伤机制的空白。模式识别受体(Pattern Recognition Receptors,PRRs),能够识别相关有害的病原微生物,通过激活半胱天冬酶(Caspase)产生一系列炎症反应,其中N样受体(NOD-like Receptors,NLRs),一种细胞膜内模式识别受体,是模式识别受体的主要成员之一,而NLRP3受体是目前为止研究最透彻的N样受体,它能够与具有C末端含有胱天蛋白酶募集域(CARD,C-terminal Caspase Recruitment Domain)的凋亡相关链状蛋白(Apoptosis-associated Speck-like Protein Containing a CARD,ASC)和半胱天冬酶(Caspase)结合生成一种特殊的多蛋白聚合体,NLRP3炎症小体,能够激活产生成熟的半胱天冬酶(Caspase)生成前炎症因子IL-1β和IL-18,进而激活不同的炎症信号通路,导致不同组织及器官的炎症损伤维持机体内环境的稳态。NLRP3受体被证实广泛存在肠道上皮细胞中,NLRP3炎症小体也被证实能够参与肠道的炎症损伤作用中。NLRP3炎症小体发挥作用主要通过以下两步骤:底物表达增加(Priming)和NLRP3炎症小体激活(Activating),其中NF-κb参与底物表达增加(Priming),能够促进NLRP3受体蛋白表达上调。而广泛存在于肠道上皮细胞中的Toll样受体4(Toll-like Receptor 4,TLR4)也已被证实能促使下游髓样分化因子88(Myeloid Differentiation Factor88,MyD88)、人白介素受体相关激酶 1(IL-1 receptor associated kinase 1,IRAK 1)和人白介素受体相关激酶4(IL-1 receptor associated kinase4,IRAK4)结合磷酸化,通过NF-κb生成的经典途径(NF-κb调控依赖途径,NFκB essential modulator(NEMO)-dependent pathway)生成 NF-κb。因此,肠道中病原微生物能够通过TLR4/NF-κb途径生成NF-κb刺激生成NLRP3炎症小体参与肠道炎性损伤作用。本实验通过建立甲基苯丙胺IEC-6细胞和C57BL/6小鼠模型,细胞和小鼠回肠末端组织出现炎性损伤,伴随相关炎症因子增加,验证甲基苯丙胺致使肠道炎性损伤;通过对比加入NLRP3炎症小体抑制剂MCC950(C20H23N2O5S.Na)的细胞及小鼠回肠末端组织,炎性损伤伴随NLRP3炎症小体过表达出现并且加入MCC950后缓解,验证甲基苯丙胺促NLRP3炎症小体过表达致肠道炎性损伤;通过对比加入 NF-κb 抑制剂 DHMEQ(Dehydroxymethylepoxyquinomicin,C13 H11 NO5)的细胞及小鼠回肠末端组织,NLRP3炎症小体及相关前炎症因子(IL-1β和IL-18)表达伴随NF-κb表达增加并且加入DHMEQ后降低,验证甲基苯丙胺通过TLR4/NF-κb途径促进NLRP3炎症小体表达。[方法]通过建立甲基苯丙胺IEC-6细胞和C57BL/6小鼠模型,在甲基苯丙胺细胞模型中,观察细胞数目及形态改变,检测细胞跨上皮细胞电阻(TEER)值变化、ELISA检测炎症因子(IL-6,IFN-γ,TNF-α和NF-κb)的表达水平;在甲基苯丙胺动物模型中,观测HE染色病理切片回肠组织损伤改变,ELISA检测炎症因子(IL-6,IFN-γ,TNF-α和NF-κb)的表达水平。在甲基苯丙胺细胞及动物模型中,加入MCC950抑制剂后,通过Western Blot及q-PCR验证抑制NLRP3炎症小体(NLRP3和Caspase-1)及其相关前炎症因子IL-1β和IL-18的蛋白及mRNA表达水平后,检测细胞跨上皮细胞电阻值(TEER),流式检测细胞的凋亡数目,Western Blot及q-PCR检测坏死性凋亡相关蛋白1(RIPK1)和3(RIPK-3)表达水平,ELISA检测炎症因子(IL-6,IFN-γ,TNF-α和NF-κb)的表达水平及观测HE染色病理切片回肠组织损伤改变。在甲基苯丙胺细胞及动物模型中,加入DHMEQ抑制剂后,通过Western Blot及q-PCR验证抑制NF-κb蛋白及mRNA表达水平后,Western Blot及q-PCR检测TLR4、NLRP3炎症小体(NLRP3,ASC和Caspase-1)及其相关前炎症因子IL-1β和IL-18表达水平。[结果]一、甲基苯丙胺致肠道炎性损伤1.甲基苯丙胺致IEC-6细胞数目降低及形态改变。2.甲基苯丙胺致IEC-6细胞跨上皮细胞电阻值(TEER)降低。3.甲基苯丙胺致小鼠回肠末端组织损伤。4.甲基苯丙胺促IEC-6细胞及小鼠回肠组织炎症因子(IL-6、TNF-α、IFN-γ和NF-κb)升高。二、甲基苯丙促NLRP3炎症小体过表达致肠道损伤1.甲基苯丙胺胺促NLRP3炎症小体过表达至IEC-6细胞坏死性凋亡,凋亡数目及坏死性凋亡相关蛋白RIPK-1和RIPK-3表达增加。2.甲基苯丙胺促NLRP3炎症小体过表达至肠道炎性损伤,MCC950通过抑制NLRP3炎症小体表达,改善甲基苯丙胺细胞及动物模型肠道炎性损伤表现。3.NLRP3炎症小体抑制剂MCC950不能抑制ASC。4.NLRP3炎症小体抑制剂MCC950不能抑制NF-κb。三、甲基苯丙胺通过TLR4/NF-κb促NLRP3炎症小体过表达1.甲基苯丙胺促TLR4和NF-κb表达。2.NF-κb抑制剂DHMEQ抑制NF-κb表达,不影响TLR4表达。3.NF-κb抑制剂DHMEQ抑制NLRP3炎症小体及其相关前炎症因子(IL-1β和IL-18)表达[结论]甲基苯丙胺能够导致IEC-6细胞和C57BL/6小鼠回肠末端组织炎性损伤,表现为细胞数目减少,形态改变,TEER降低,HE染色病理切片损伤改变及炎症因子(IL-6,IFN-γ,TNF-α和NF-κb)升高;甲基苯丙胺促NLRP3炎症小体过表达致肠道炎性损伤,表现为MCC950抑制NLRP3炎症小体(NLRP3和Caspase-1)及其相关前炎症因子IL-1β和IL-18表达后,细胞坏死性凋亡数减少,坏死性凋亡相关蛋白RIPK-1和RIPK-3减少,TEER上升,细胞及回肠组织炎症因子(IL-6,IFN-γ,TNF-α)降低及HE染色病理切片炎性损伤缓解;甲基苯丙胺通过TLR4/NF-κb途径促NLRP3炎症小体过表达,表现为DHMEQ抑制NF-κb表达后,NLRP3炎症小体(NLRP3,ASC和Caspase-1)及其相关前炎症因子IL-1β和IL-18明显下降。因此,甲基苯丙胺能够通过TLR4/NF-κb促NLRP3炎症小体过表达致肠道炎性损伤。