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蛋白激酶C受体1(Receptor for Activated C Kinase1,RACK1)作为高度保守的WD40骨架蛋白,由7片β螺旋桨结构组成,与多种信号蛋白存在相互作用,包括激酶、磷酸化酶、转录因子、膜蛋白等。有别于动物和其他物种,植物RACK1存在多个RACK1基因拷贝。拟南芥就有三个RACK1基因,分别是RACK1A、RACK1B和RACK1C。植物RACK1参与调控了众多的细胞生化途径,包括多种植物激素信号,种子萌发,天然免疫,核糖体翻译,microRNA积累,干旱、盐和淹水胁迫的响应等。其中,盐碱化、干旱胁迫等非生物胁追是我们农业生产的重要限制因素,但植物RACK1调控非生物胁迫的具体机制仍然知之甚少。本研究以拟南芥为材料,采用分子生物学和遗传学等手段,深入研究了拟南芥RACK1B在植物响应盐、渗透、干旱胁迫中发挥作用的具体机制。 通过比较拟南芥rack1b突变体和RACK1B转基因过表达株系,发现RACK1B功能缺失上调了种子萌发阶段对盐胁迫和渗透胁迫的抗性,RACK1B过表达互补株系增强了种子萌发阶段对盐胁迫和渗透胁迫的敏感性。qRT-PCR实验结果揭示了盐胁迫和渗透胁迫显著上调了rack1b突变体中的AKT1的转录水平。蛋白印迹实验发现根部负责钾离子内流的主效通道AKT1在rack1b突变体中被显著上调,而在过表达互补株系中则被恢复到野生型水平。突变体rack1b中上调的AKT1蛋白水平与其抗盐抗渗透胁迫的表型刚好吻合。爪蟾卵母细胞中共表达拟南芥RACK1B和AKT1显示RACK1B以剂量依赖的方式抑制了AKT1在爪蟾卵母细胞膜上的分布,而且RACK1B可以以剂量依赖的方式抑制AKT1的钾离子转运活性。由此,可以得出RACK1B是在转录和转录后两个水平上负调控了AKT1,从而抑制了拟南芥的抗盐抗渗透能力。 拟南芥RACK1B功能缺失表现为干旱敏感的表型;过表达RACK1B提高了干旱胁迫的抗性。RACK1B调控干旱胁迫的响应也与钾离子运输密切相关。在气孔保卫细胞中,钾离子运输与水分运输偶联,钾离子外排流速越快,气孔关闭越快,植物抗旱性强;反之则干旱敏感。ABA作为干旱诱导的植物激素,可以直接调控气孔关闭,减少水分散失。气孔保卫细胞非损伤微电极测试结果显示,rack1b突变体在瞬时添加ABA处理后不能有效的增加钾离子的外排流速,过表达株系同野生型一样都可以有效地响应ABA诱导的钾离子外排激活。这些结果揭示了RACK1B功能缺失后拟南芥不能有效地响应ABA诱导的钾离子外排激活过程,从而造成干旱敏感的表型。泛素依赖的膜蛋白酵母双杂实验显示,RACK1B可以与气孔特异表达钾离子内流通道KAT1相互作用。蛋白印迹实验表明RACK1B敲除和过表达并不影响拟南芥KAT1的膜组分蛋白表达量。在爪蟾卵母细胞中共注射表达拟南芥KAT1和RACK1B cRNA,结果显示RACK1B以剂量依赖的方式抑制了KAT1的钾离子转运活性。瞬时注射原核表达的6His-RACK1B蛋白同样可以抑制KAT1的活性。多项研究表明14-3-3蛋白对钾离子通道转运钾离子活性具有调控的能力,筛选酵母双杂交文库、体内免疫共沉淀和荧光互补实验鉴定到一个与RACK1B互作的14-3-3蛋白成员GRF6。在爪蟾卵母细胞中共注射GRF6 cRNA发现GRF6对KAT1活性无显著影响,但GRF6可以恢复RACK1B对KAT1活性的抑制作用。瞬时注射原核表达的GST-GRF6融合蛋白对KAT1的活性略有抑制,同样能恢复6His-RACK1B蛋白对KAT1活性的抑制作用。这些结果说明了RACK1B可以有效的抑制KAT1的活性,从而调控气孔运动;GRF6则主要通过解除RACK1B对KAT1的抑制来间接调控KAT1活性,从而参与气孔调节。 我们的研究揭示了拟南芥RACK1B通过抑制根和保卫细胞中的钾离子通道蛋白的钾离子转运活性,参与盐胁迫、渗透胁迫、干旱胁迫的调控。RACK1B相互作用蛋白GRF6能够解除RACK1B对钾离子内流通道KAT1的活性抑制,共同调控气孔运动。这些新的发现,有助于我们更好地了解RACK1B调控非生物胁迫响应的机制,并为我们遗传改良作物提供理论基础。