第一部分类固醇生成因子-1及DAX-1mRNA在肾上腺皮质肿瘤中的表达目的:近年对与肾上腺皮质肿瘤相关的遗传综合征分子机制研究的进展使人们关注散发性肾上腺皮质肿瘤的发病机制。类固醇生成因子-1(Steroidogenic factor-1,SF-1)和X染色体上与剂量敏感的性反转-先天性肾上腺萎缩相关的基因-1(Dosage-sensitive sexreversal,adrenal hypoplasia congenital,critical region on the X chromosome gene-1,DAX-1)均是孤儿核受体,SF-1结合到DAX-1启动子区可发挥协同转录抑制作用,不仅可以抑制类固醇合成的急性调节蛋白(StAR)、3β羟类固醇脱氢酶、CYP11A、CYP17、CYP1182等多种参与类固醇合成的酶的转录,还可调节HPA轴的其他组份如ACTH-R、GnRH-R、LH-β亚单位及FSH-β亚单位等的表达,在肾上腺和性腺的发生、维持下丘脑—垂体—肾上腺轴正常功能以及促肾上腺皮质激素受体(ACTH-R)基因组织特异性表达中起了重要作用。体外研究表明SF-1可刺激肾上腺皮质细胞增生,而DAX-1可能抑制肿瘤细胞增殖及分化,提示二者在肾上腺肿瘤的发生中也可能具有重要作用。本研究拟检测SF-1、DAX-1mRNA在肾上腺皮、髓质肿瘤以及正常肾上腺皮质中的表达,初步探讨SF-1、DAX-1在肾上腺肿瘤尤其是醛固酮分泌瘤中的作用。方法:1、用TRIZOL分别提取肾上腺醛固酮分泌瘤(APA,n=17),包括血管紧张素Ⅱ(AⅡ)无反应的醛固酮分泌瘤(AⅡ-U-APA,n=12)和血管紧张素Ⅱ有反应的醛固酮分泌瘤,(AⅡ-R-APA,n=5)、肾上腺醛固酮皮质癌(n=2)、肾上腺皮质醇分泌瘤(n=10)、肾上腺无功能瘤(n=10)、肾上腺嗜铬细胞瘤(PHEO,n=6)和正常肾上腺皮质(n=8)组织的总RNA;2、实时荧光定量PCR方法检测上述不同组织中SF-1、DAX-1、ACTH-R基因和内参照β-actin mRNA的表达;3、比较SF-1、DAX-1、ACTH-R mRNA在上述不同组织中的表达差异,并与肾上腺皮质肿瘤患者的临床资料行相关性分析。结果:1.SF-1 mRNA在肾上腺皮质肿瘤中的表达1)在APA中表达和正常肾上腺皮质相比无明显统计学差异,SF-1/β-actin mRNA比值分别为23.89±3.17(AⅡ-U-APA)、21.59±3.00(AⅡ-R-APA)和24.58±2.45(正常肾上腺皮质)(p＞0.05);2)在皮质醇分泌瘤中表达(14.17±2.80)明显低于正常肾上腺皮质及APA,差异有明显统计学意义(p均＜0.01);3)在肾上腺无功能瘤中表达(36.38±3.50),明显高于正常肾上腺皮质、APA和皮质醇分泌瘤(p均＜0.01);4)2例肾上腺分泌醛固酮的肾上腺皮质癌中表达(分别为38.75和44.16)有明显高于其他各组的趋势。2.DAX-1mRNA在肾上腺皮质肿瘤中的表达1)在APA中的表达明显低于正常肾上腺皮质,DAX-1/β-actin mRNA比值分别为0.37±0.05(AⅡ-U-APA p＜0.01)、0.43±0.05(AⅡ-R-APA p＜0.05)及0.57±0.06(正常肾上腺皮质);2)在皮质醇分泌瘤中表达(0.39±0.04)明显低于正常肾上腺皮质(p＜0.01);3)在无功能瘤中表达(0.83±0.08)明显高于正常肾上腺皮质、APA和皮质醇分泌瘤(p均＜0.01);4)在2例肾上腺皮质癌中表达(分别为1.52和1.21)有明显高于其他各组的趋势。3.ACTH-RmRNA在肾上腺肿瘤中的表达1)ACTH-R/β-actin mRNA比值在AⅡ-U-APA中(1.41±0.18)明显高于AⅡ-R-APA(1.17±0.25),两组均明显高于正常肾上腺皮质(0.94±0.10)(p＜0.05或0.01);2)在皮质醇分泌瘤中(0.55±0.05)明显低于正常肾上腺皮质和APA(p均＜0.01);3)在无功能瘤中(0.71±0.26)明显低于正常肾上腺皮质和APA(p＜0.05或0.01);4)在2例肾上腺皮质癌中(分别为0.48和0.43)有明显低于其他各组的趋势。4.SF-1/DAX-1比值在肾上腺皮质肿瘤中的差异1)SF-1/DAX-1比值在AⅡ-U-APA中(58.78±12.08)明显高于AⅡ-R-APA(46.19±5.64)、正常肾上腺皮质(43.70±6.44)、皮质醇分泌瘤(36.16±6.89)及肾上腺无功能瘤(44.00±5.32)(p＜0.05或0.01);2)AⅡ-R-APA中SF-1/DAX-1比值也明显高于皮质醇分泌瘤(p＜0.05)。5.SF-1、DAX-1和ACTH-R mRNA表达与肾上腺皮质肿瘤患者的临床相关性1)醛固酮分泌瘤a).AⅡ-U-APA患者立位刺激后血浆醛固酮水平变化(立位减卧位醛固酮的差值,即△醛固酮)与ACTH-R mRNA呈负相关(r=—0.663,p=0.019)、与DAX-1mRNA呈正相关(r=0.655,p=0.021)、并与SF-1/DAX-1比值呈负相关(r=-0.432,p=0.046);b).AⅡ-U-APA肿瘤大小与SF-1/DAX-1比值呈负相关(r=-0.712,p=0.009),而与SF-1、DAX-1、ACTH-RmRNA表达无明显相关(p均＞0.05);c).AⅡ-R-APA患者△醛固酮仅与ACTH-R mRNA呈正相关(r=0.900,p=0.037),与DAX-1mRNA呈负相关(r=-1.000,p=0.000)。2)皮质醇分泌瘤a).肿瘤中SF-1、DAX-1、ACTH-R mRNA表达与血、尿皮质醇水平无明显相关(p均＞0.05);b).皮质醇肿瘤大小仅与SF-1 mRNA表达呈明显正相关(r=0.695,p=0.026)。6.SF-1、DAX-1和ACTH-R mRNA在嗜铬细胞瘤中均未见表达。结论:1.SF-1和DAX-1 mRNA在肾上腺皮质醛固酮瘤、皮质醇瘤、无功能瘤及良恶性醛固酮肿瘤中的表达不同,证实SF-1、DAX-1与肾上腺皮质肿瘤的发生密切相关;2.AⅡ-U-醛固酮瘤组织中SF-1 mRNA正常、DAX-1 mRNA表达减低、SF-1/DAX-1比值增高且与醛固酮瘤大小呈明显负相关,提示DAX-1低表达可能影响AⅡ无反应的醛固酮分泌瘤的生长;3.SF-1和DAX-1 mRNA在肾上腺皮质无功能瘤及分泌醛固酮的肾上腺皮质癌中高表达,显示SF-1和DAX-1可能促进分泌醛固酮的肾上腺皮质癌的发生并应追随无功能瘤的预后;4.SF-1在皮质醇瘤中明显减低并与皮质醇瘤大小呈正相关,提示SF-1与皮质醇瘤的发生密切相关;5.DAX-1、SF-1mRNA在嗜铬细胞瘤中无表达,可能与嗜铬细胞瘤发病无关。6.上述部分结果目前未见国内外文献报告。第二部分SF-1、DAX-1蛋白在肾上腺皮质肿瘤中的表达目的:第一部分研究从mRNA水平显示SF-1、DAX-1在正常肾上腺皮质及肾上腺皮质肿瘤中的表达存在差异,而在嗜铬细胞瘤中无表达;醛固酮分泌瘤的SF-1/DAX-1比值明显高于其他肾上腺皮质肿瘤。因目的基因的转录和翻译均有严密的调控,故本研究第二部分拟观察SF-1和DAX-1在正常肾上腺皮质及肾上腺皮质肿瘤中的蛋白水平表达,进一步从蛋白水平探讨SF-1和DAX-1与肾上腺皮质肿瘤特别是醛固酮分泌瘤的关系,并分析与mRNA表达水平上的异同。方法:1.分别提取肾上腺醛固酮分泌瘤(APA,n=17),包括血管紧张素Ⅱ(AⅡ)无反应的醛固酮分泌瘤(AⅡ-U-APA,n=12)和血管紧张素Ⅱ有反应的醛固酮分泌瘤,(AⅡ-R-APA,n=5)、肾上腺醛固酮皮质癌(n=2)、肾上腺皮质醇分泌瘤(n=10)、肾上腺无功能瘤(n=8))和正常肾上腺皮质(n=8)组织的总蛋白,并测定蛋白浓度。2.Western blot方法检测上述不同组织中SF-1、DAX-1和内参β-actin的表达;分析目的条带和内参照条带的灰度比值,对SF-1、DAX-1的表达进行半定量分析。3.比较上述不同组织中SF-1、DAX-1蛋白表达的差异。并对SF-1和DAX-1蛋白在肾上腺皮质肿瘤中的表达水平与相应患者的临床资料行相关性分析。并分析与mRNA表达水平上的异同。结果:1.SF-1蛋白在肾上腺皮质肿瘤中的表达1)醛固酮分泌瘤:SF-1/β-actin蛋白表达在正常肾上腺皮质与AⅡ-U-APA及AⅡ-R-APA中分别为0.76±0.11、0.76±0.10和0.73±0.07,三组间差异无统计学意义(p＞0.05);2)皮质醇分泌瘤:SF-1蛋白表达(0.55±0.04)明显低于正常肾上腺皮质及醛固酮分泌瘤(p均＜0.01);3)肾上腺无功能瘤:SF-1蛋白表达(0.98±0.10)明显高于正常肾上腺皮质、醛固酮分泌瘤和皮质醇分泌瘤(p均＜0.01);4)SF-1蛋白在2例肾上腺皮质癌中的表达(1.24和1.40)有明显高于其他各组的趋势。2、DAX-1蛋白在肾上腺皮质肿瘤中的表达1)醛固酮分泌瘤:DAX-1/β-actin蛋白表达在醛固酮分泌瘤中明显低于正常肾上腺皮质,分别为:正常肾上腺皮质0.65±0.14、AⅡ-U-APA0.39±0.13,AⅡ-R-APA 0.43±0.14,均p＜0.01;2)皮质醇分泌瘤:DAX-1蛋白表达(0.56±0.04)明显低于正常肾上腺皮质(p＜0.05),但高于AⅡ-U-APA(p＜0.01);3)肾上腺无功能瘤:DAX-1蛋白表达(1.03±0.13)明显高于正常肾上腺皮质、醛固酮分泌瘤和皮质醇分泌瘤(p均＜0.01);4)DAX-1蛋白在2例肾上腺皮质癌中(1.18和1.02)有明显高于其他各组的趋势。3、SF-1/DAX-1比值在肾上腺皮质肿瘤中的变化1)SF-1/DAX-1蛋白比值在AⅡ-U-APA(2.28±0.79)和AⅡ-R-APA(1.56±0.44)中明显高于正常肾上腺皮质(1.20±0.18)、皮质醇分泌瘤(1.00±0.11)和无功能瘤(0.96±0.14)(p＜0.01);2)在AⅡ-U-APA中SF-1/DAX-1比值高于AⅡ-R-APA,醛固酮分泌瘤两组间有统计学显著差异(p＜0.01)。4、SF-1和DAX-1蛋白表达的临床意义1)AⅡ-U-APA组立位刺激后血浆醛固酮水平的变化(立位减卧位醛固酮的差值,即△醛固酮)与DAX-1蛋白呈明显正相关(r=0.616,p=0.033)、与SF-1/DAX-1比值呈负相关(r=-0.588,p=0.044)、而与SF-1蛋白无相关性(p＞0.05);2)醛固酮瘤大小与SF-1/DAX-1比值呈明显负相关(r=-0.580,p=0.048);3)皮质醇分泌瘤中DAX-1蛋白与24h尿游离皮质醇水平呈明显正相关(r=0.709,p=0.022);SF-1与血、尿皮质醇水平均无明显相关(p均＞0.05);4)皮质醇肿瘤大小与SF-1蛋白呈明显正相关(r=0.677,p=0.032)。结论:1.从蛋白水平也证实,SF-1和DAX-1在肾上腺良恶性醛固酮肿瘤、皮质醇瘤、无功能瘤中的表达存在差异,证实SF-1、DAX-1与肾上腺皮质肿瘤的发生密切相关;2.AⅡ-U-醛固酮瘤组织中SF-1蛋白正常、DAX-1蛋白表达减低、SF-1/DAX-1比值增高且与醛固酮瘤大小呈负相关,提示DAX-1低表达可能影响AⅡ无反应的醛固酮分泌瘤的生长。3.翻译水平也证实,SF-1和DAX-1在肾上腺皮质无功能瘤及分泌醛固酮的肾上腺皮质癌中均呈高表达,进一步提示SF-1和DAX-1可能促进分泌醛固酮的肾上腺皮质癌的发生并应追随无功能瘤的预后;4.SF-1蛋白在皮质醇瘤中低表达并与皮质醇瘤大小呈正相关,提示SF-1可能参与皮质醇瘤的发生;5.上述部分结果目前未见国内外文献报告。