卵巢组织的冷冻保存在生殖上具有卵子与胚胎冷冻所不可替代的优越性，它无需控制供体的生殖周期及取卵，可用于保存濒危动物或受意外伤害的人或动物的卵母细胞，为性成熟前失去生殖能力的动物或人提供生殖保险以及增加卵母细胞的来源，并可用于建立生殖细胞(卵母细胞)的冷冻库。同时卵巢皮质含大量的各阶段未成熟卵泡，而原始卵泡对低温的敏感性比成熟卵泡要低。因此随着低温生物学技术及生殖医学的发展，卵巢组织的冷冻成为了保存女性生殖能力最具潜力的选择。尽管已有冷冻卵巢组织成功应用临床的报道，但卵巢组织的冷冻技术仍不完善，还有许多问题尚未解决，其问题之一就是确立最佳冷冻方案，迄今为止尚未找到一种最佳的冷冻方案。而真正将卵巢组织的冷冻保存应用于人类，现在的方法主要有自体移植、异体移植、体外培养，自体移植已经应用于临床并已产下健康的婴儿，但是由于体外培养系统的不完善，目前的体外培养技术仍停留在实验阶段。目的在本研究中我们应用小鼠作为动物模型，研究不同的冷冻保护剂对于卵巢组织冷冻的效果，并研究冷冻后小鼠的窦前卵泡体外生长发育及不同的培养成分对于卵泡体外发育的影响，以期能够找到较好卵巢组织冷冻及卵泡体外成熟的方案，为人类卵巢组织的冷冻选择合适的冷冻保护剂及体外培养系统，从而为建立人卵巢组织库提供依据。材料与方法1．研究对象为4周龄雌性昆明小白鼠60只，由河南省实验动物中心提供。小鼠饲养暗周期14小时，光照10小时，自由取水和饮食。2．切除小鼠双侧卵巢，在显微镜下分割成1×1×1-2mm的小块。放入1.5M的DMSO、PROH、EG的冷冻保护剂中，分别应用一步法和三步法进行平衡，装入冷冻管后直接投入液氮中。解冻时在37℃的水中复温5min，放入解冻液中置换出冷冻保护剂，放入培养箱平衡30min。3．应用不同的方法分离组织块中的窦前卵泡，机械分离法将卵巢剪碎吹打后直接用针头分离；酶分离法为应用0.1％的胶原酶消化20min后拣出卵泡；机械+酶分离法为先用酶消化10min，然后再机械分离卵泡。4．体外卵泡培养液分为4种，基础培养液：10％SPS+10μg／ml胰岛素+5.5μg／ml转铁蛋白+6.7 ng／ml硒(1％ITS)+100mIU／mlFSH+α-MEM液；EGF组：基础培养液+0.05mg／mlEGF；GDF-9组：基础培养液+100μg／mlGDF-9；EGF+GDF-9组：基础培养液+0.05mg／mlEGF+100μg／ml GDF-9；对照组为在基础培养液中培养的新鲜卵泡。将形态正常卵泡放入不同的培养液做成的微滴中，每个微滴放入2-4个卵泡进行体外培养12天，隔天将微滴中的液体一半换成新鲜的液体。换液时在显微镜下观察卵泡生长情况并测量卵泡直径。5．在第12天将微滴中的液体换为体外成熟液，培养15h后，观察OCC排出及GVBD情况，去除颗粒细胞，收集成熟卵子。6．统计方法：采用SPSS10.0统计学软件对实验数据进行统计学分析。均数的比较应用t检验，率的比较应用χ~2检验。实验数据以均数±标准差((?)±s)或百分率表示，以α=0.05为检验水准，以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著性。结果1、不同平衡方案对卵巢组织形态学的影响一步平衡组的正常形态卵泡率(43.5％)和窦前卵泡率(43.8％)明显低于对照组(82.1％，76.7％)和三步平衡组(74.1％，72.9)，P＜0.01。三步平衡组与对照组相比较无统计学意义，P＞0.05。2、不同组别卵巢组织中各级卵泡的构成比例各组中窦前卵泡均占较大的比例。对照组的初级卵泡、次级卵泡、窦前卵泡及窦卵泡所占比例分别为5.6％、8.3％、83.3％、2.8％，各组相比较，各级卵泡的构成比均无统计学意义，P＞0.05。3、不同冷冻保护剂对卵巢组织形态学的影响冷冻复苏后的卵巢组织部分卵泡发生闭锁，卵泡失去正常的圆形结构，卵泡膜完整性遭到破坏；有些卵泡虽然保持正常的形态，卵泡膜完整，但是卵子出现空泡或发生皱缩；另外有分离出的结构正常的卵泡在倒置显微镜下观察可发现卵子变暗。这种现象在新鲜的卵巢组织中则较少见。与对照组比较，DMSO组和PROH组正常形态卵子率明显低于对照组P＜0.01；EG组的正常形态卵泡率和窦前卵泡率低于对照组，P＜0.05，正常形态卵子率明显低于对照组，P＜0.01。冷冻组间两两比较，EG组的正常形态卵子率低于DMSO组，P＜0.05，与PROH组间无明显差异，P＞0.05；DMSO组与PROH组之间比较无统计学意义，P＞0.05。4、不同冷冻保护剂对卵泡体外发育的影响与对照组比较，各冷冻组的D4天存活率及卵泡直径的增幅均低于对照组，P＜0.05，三组冷冻组间两两比较均无明显差异，P＞0.05。5、不同的分离方法对卵泡数量及卵泡质量的影响酶分离法和酶+机械分离法分离得到的卵泡明显高于机械分离法，P＜0.01，酶分离法所得到的正常卵泡率明显低于其他两组，P＜0.01，其余比较无统计学意义，P＞0.05。6、小鼠窦前卵泡体外生长情况培养第2～3天，卵泡贴壁，不能移动；第4天颗粒细胞数目明显增多；第5～6天颗粒细胞层增多，颗粒细胞明显越过基底膜生长，难以清晰观察卵母细胞；卵泡逐渐失去球形的三维结构；第7～10天，卵泡出现窦腔样结构；第13天，卵丘逸出；去掉卵丘细胞后见到成熟卵母细胞。在最初的4天，卵泡生长缓慢，从第6天开始卵泡生长加速，最终在12天左右达到成熟卵泡标准(＞400μm)。在进行多个卵泡培养时，在培养过程中常常有2个或2个以上的卵泡相互聚集在一起，黏附成团状，无法测量卵泡的直径。在培养后期，卵泡膜结构完整的卵泡形成卵泡腔；卵泡膜结构不完整，颗粒细胞扩展生长也可出现腔样结构，形成卵丘，卵丘周围颗粒细胞减少或消失。窦前卵泡体外微滴培养时，还可能发生卵泡破裂，卵母细胞脱出。7、培养液中不同的添加成分对于卵泡体外发育的影响7．1不同添加成分对卵泡体外存活率的影响D12天对照组、基础培养液组、EGF组、GDF-9组和EGF+GDF-9组的卵泡存活率分别为41.3％、33.2％、50.0％、49.6％、51.3％。与对照组比较，基础培养组的D6、D8、D10、D12天的存活率低于对照组，P＜0.05；EGF组和GDF组的D10、D12天的存活率高于对照组，P＜0.05；EGF+GDF组的D4、D6天的存活率高于对照组，P＜0.05，D8、D10、D12天的存活率明显高于对照组，P＜0.01。基础培养液组、EGF组、GDF-9组和EGF+GDF-9组两两比较，EGF组、GDF-9组的D6天卵泡存活率与基础培养组比较有统计学意义，P＜0.05，D8、D10、D12天的卵泡存活率明显大于基础培养组；EGF+GDF组的D4天存活率与基础培养组比较有统计学意义，D6、D8、D10、D12天的存活率明显高于基础培养组，P＜0.01。EGF组、GDF-9组和EGF+GDF-9组之间存活率比较无统计学意义，P＞0.05。7．2不同添加成分对卵泡及卵母细胞体外发育的影响EGF+GDF-9组的卵泡体外发育较快，培养12天后的直径较多超过400μm，最大可达到450μm以上。对照组、基础培养液组、EGF组、GDF-9组和EGF+GDF-9组D0天的卵泡及卵子的直径比较无统计学意义，P＞0.05。基础培养液组D12天的卵泡、卵母细胞的直径和直径增幅小于对照组，P＜0.05；EGF组与GDF-9组的卵泡、卵母细胞的直径与直径增幅均高于对照组，P＜0.05；EGF+GDF组的卵泡、卵母细胞直径与直径增幅明显高于对照组。基础培养组、EGF组、GDF-9组与EGF+GDF-9组之间两两比较，EGF组、GDF-9组与EGF+GDF-9组的卵泡、卵母细胞直径与直径增幅明显高于基础培养组，P＜0.01。EGF组、GDF-9组与EGF+GDF-9组之间比较无统计学差异，P＞0.05。7．3不同添加成分对卵泡排卵率、GVBD率和MII形成率的影响新鲜对照组的卵泡存活率、OCC释放率、GVBD率、MII形成率分别为41.3％，63.6％，65.9％，13.4％。基础培养组的卵泡存活率(33.2％)、GVBD率(48.3％)、MII形成率(3.4％)低于对照组，P＜0.05；EGF组、GDF-9组的卵泡存活率(50.0％、49.6％)比对照组高，P＜0.05；EGF+GDF-9组的卵泡存活率(51.3％)、GVBD率(78.3％)、MII形成率(24.8％)高于对照组，P＜0.05。基础培养组、EGF组、GDF-9组和EGF+GDF-9组两两比较，EGF组、GDF-9组的卵泡存活率、GVBD率、MII形成率高于基础培养组，P＜0.05；EGF+GDF-9组的卵泡存活率、GVBD率、MII形成率明显高于基础培养组，P＜0.01，其余比较无统计学意义。8、培养天数对于冷冻复苏后卵泡发育的影响与新鲜对照组比较，冷冻复苏后培养12天的卵泡直径增幅、卵泡存活率、GVBD率、MII形成率均明显低于新鲜对照组，P＜0.01；冷冻复苏后培养14天的卵泡直径增幅明显低于对照组，P＜0.01，MII的形成率比对照组低，P＜0.05；冷冻复苏后培养16天与对照组各项比较均无统计学意义，P＞0.05。冷冻复苏后培养12天、14天、16天两两比较，培养14天的GVBD率高于培养12天；培养16天的卵泡直径增幅、GVBD率、MII形成率均高于培养12天，P＜0.05。培养14天与培养16天比较无统计学意义，P＞0.05。小结1、应用三步平衡法可改善卵巢组织冷冻的结果。DMSO是一种有效的冷冻保护剂，能够减少冷冻对于卵巢组织的损伤，可以应用于小鼠卵巢组织的冷冻。2、机械+酶分离法得到较多质量较好的卵泡，是一种较好的的卵泡分离方法。3、在体外培养液中加入EGF与GDF-9因子能够促进卵泡的体外发育和成熟，EGF与GDF-9因子联合应用更能有效地促进卵泡的体外发育4、延长培养时间可以促进卵泡直径的增加及卵泡、卵子的成熟，与新鲜的卵泡比较，冷冻后卵泡的发育潜能下降。