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目的骨髓增生异常综合征(MDS)一种高度异质性的髓系肿瘤,约有30%的MDS患者可能进展为急性髓系白血病(AML,亦称sAML),一旦转变预后极差。截至目前为止,MDS疾病转变的机制尚未完全明确,遗传学和表观遗传学改变在其中扮演重要作用。本研究旨在探究MDS转AML中全基因组DNA甲基化改变,同时筛选和验证驱动疾病进展相关的表观分子,并分析其临床意义。方法应用全基因组简化甲基化测序(RRBS)分析4例对照和4例配对MDS/sAML患者不同阶段甲基化态势。同时应用生物信息等方法筛选具有预后意义和潜在生物学功能的相关基因。应用实时定量甲基化特异性PCR(RQ-MSP)、亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)及MethylTarget靶向测序等方法进一步扩大标本验证和确定候选基因甲基化改变。实时定量PCR(RQ-PCR)及Western Blot(WB)等方法检测候选基因的表达水平。基于临床标本参数等进行临床意义和预后分析。同时通过细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖等实验评价候选基因功能。结果在4例配对MDS/sAML患者中,随着疾病进展处于sAML阶段的全基因组甲基化水平显著高于MDS阶段。MDS阶段与对照相比,一共筛选出1090个差异性甲基化片段(DMFs),包括441个高甲基化片段及649个低甲基化片段。sAML阶段与MDS阶段相比,一共筛选出103个DMFs,其中包括96个高甲基化片段及7个低甲基化片段。针对4例配对MDS/sAML患者单独比较,我们分别筛选出5803个、3735个、4043个及2748个差异甲基化基因(DMGs)。结合初步筛选和生物信息分析发现目标分子ID4和DLX5不仅和AML预后密切相关,并且可能有参与肿瘤生成作用。此外,通过RQ-MSP方法进一步扩大标本确定MDS转AML中ID4和DLX5的高甲基化改变现象。MDS和AML患者中ID4甲基化水平显著高于对照组(P<0.001),此外,以IPSS危险程度分组比较,Int-2/High危险组患者ID4甲基化水平显著高于Low/Int-1危险组患者(P=0.004),sAML患者ID4甲基化水平也显著高于原发AML(pAML)患者(P=0.003)。ID4高甲基化组MDS患者的总体生存(OS)短于ID4低甲基化组MDS患者,差异具有统计学意义(P=0.038)。通过Cox回归多因素分析发现ID4高甲基化并不是MDS患者预后不良的独立影响因素(HR=1.643,P=0.433)。ID4高甲基化组AML患者的完全缓解率(CR)与ID4低甲基化组AML患者无差异(P=0.629)。在非M3患者中,ID4高甲基化组AML患者的CR率略低于ID4低甲基化组AML患者(P=0.202)。然而在正常核型AML(CN-AML)中,ID4高甲基化组AML患者的CR率显著低于ID4低甲基化组AML患者(P=0.030)。18例AML患者经过诱导化疗达到CR后ID4甲基化水平有不同程度下降(P<0.001)。通过Kaplan-Meier生存分析发现:ID4高甲基化组AML患者的OS和无白血病生存(LFS)短于ID4低甲基化组AML患者(P=0.002及P=0.001)。在CN-AML中,ID4高甲基化组AML患者的OS明显短于ID4低甲基化组AML患者(P=0.001);然而,两组之间的LFS差异并无统计学意义(P=0.326)。Cox回归多因素分析发现:ID4高甲基化是CN-AML患者预后不良的独立影响因素(HR=2.483,P=0.004),而在非M3患者中,趋近统计学意义(HR=1.507,P=0.081)。AML患者中ID4的表达水平较对照显著下调(P=0.003),且ID4甲基化和ID4表达呈负相关(R=-0.275,P=0.001)。其次,我们选取ID4高甲基化、低表达的白血病细胞株K562通过DAC进行去甲基化处理,随着DAC浓度提高,ID4甲基化水平逐步下降,同时ID4的mRNA和蛋白水平呈现上调。功能实验发现转染ID4后K562和HL60细胞增殖能力下降,细胞周期阻滞在G0/G1期,细胞凋亡增加。前期通过生物信息分析发现ID4不仅受到DNA甲基化调控,还可能受到miR-335调控,AML患者中miR-335水平较对照组显著上调(P=0.009),且和ID4表达呈负相关(R=-0.146,P=0.043)。与大多数报道不同,我们发现AML中miR-335甲基化与对照并无差异。MiR-335和ID4均异常表达组AML患者的CR率最低,miR-335或者ID4任何一个异常表达组次之,miR-335和ID4表达正常组最高,三组之间具有显著统计学差异(34%、40%和63%,P=0.024)。在非M3患者中,三组的CR率分别是25%、31%和55%,三组之间有显著统计学差异(P=0.029)。在CN-AML中,三组的CR率分别是25%、37%和68%,三组之间依然有显著统计学差异(P=0.018)。通过Logistic回归多因素分析发现:miR-335/ID4表达是非M3AML以及CN-AML患者经过诱导化疗是否达CR的独立影响因素(HR=2.010,P=0.033和HR=3.224,P=0.009)。miR-335高表达AML患者的OS和LFS短于miR-335低表达组AML患者,差异统计学意义(P=0.001及P<0.001)。同时,ID4低表达AML患者的OS和LFS短于ID4高表达组AML患者,差异有统计学意义(P<0.001及P=0.020)。在CN-AML中,miR-335高表达AML患者的OS和LFS短于miR-335低表达组AML患者,差异有统计学意义(P=0.002及P=0.003)。同时,ID4低表达AML患者的OS和LFS短于ID4高表达组AML患者,差异有统计学意义(P=0.001及P=0.026)。MiR-335和ID4均异常表达组AML患者的OS及LFS最短,miR-335或者ID4任何一个异常表达组次之,miR-335和ID4表达正常组最长,三组之间具有明显统计学差异(P<0.001及P<0.001)。在CN-AML中,三组之间依然存在显著统计学差异(P<0.001及P=0.003)。通过Cox回归多因素分析发现:miR-335/ID4表达是非M3 AML及CN-AML患者预后不良的独立影响因素(HR=1.894,P<0.001及HR=2.376,P<0.001)。通过功能实验发现转染miR-335后K562和HL60细胞增殖能力增加,细胞凋亡减弱。同时通过WB检测发现增殖相关蛋白PCNA和CyclinD1表达水平增高,而促进凋亡相关蛋白Caspase-3表达水平下降。经过功能拯救实验发现转染ID4后K562/miR-335和HL60/miR-335细胞增殖能力下降,细胞凋亡增加。同时通过WB检测发现增殖相关蛋白PCNA和CyclinD1表达水平降低,而促进凋亡相关蛋白Caspase-3表达水平上升。结合生物信息分析发现miR-335/ID4表达异常和PI3K/Akt信号通路密切相关。通过WB检测并且确认过表达miR-335可以上调AKT和pAKT的水平。同时,K562和HL60细胞中,经过AKT抑制剂MK2206处理后,miR-335促进细胞增殖及抑制细胞凋亡的能力减弱,进一步证实miR-335通过PI3K/Akt信号通路发挥的促进肿瘤发生发展的作用。通过MethyTarget靶向测序发现MDS患者(n=35)中DLX5甲基化水平略高于对照(n=25)(P=0.063),而AML患者(n=111)中DLX5甲基化水平显著高于对照及MDS患者(P<0.001及P<0.001)。此外,我们扩大MDS和AML标本,通过RQ-MSP方法检测发现MDS患者(n=61)、pAML患者(n=148)及sAML患者(n=11)中DLX5甲基化水平均较对照(n=46)上调(P=0.034、P<0.001及P<0.001);此外,sAML患者DLX5甲基化水平也显著高于pAML患者(P=0.008)。RQ-MSP结果和靶向测序结果有相关性(R=0.566,P<0.001)。ROC曲线分析表明DLX5甲基化可以作为潜在的生物学标记来区分AML/MDS患者和对照组,其AUC=0.715(P<0.001)及AUC=0.620(P=0.034)。DLX5高甲基化组AML患者的CR率显著低于DLX5低甲基化组AML患者(P=0.043)。在非M3患者中,DLX5高甲基化组AML患者的CR率与DLX5低甲基化组AML患者并无差异(P=0.135)。在CN-AML中,DLX5高甲基化组AML患者的CR率略低于DLX5低甲基化组AML患者(P=0.081)。Logistic回归多因素分析发现:DLX5甲基化趋近于是AML患者经过诱导化疗是否达CR的独立影响因素(HR=0.452,P=0.067)。DLX5高甲基化组MDS患者的OS和LFS显著短于DLX5低甲基化组MDS患者,差异有统计学意义(P=0.010及P=0.006)。Cox回归多因素分析发现:DLX5高甲基化是MDS患者OS及LFS缩短的独立危险因素(HR=2.340,P=0.038及HR=2.394,P=0.030)。此外,在全部AML和非M3 AML中,DLX5高甲基化组AML患者的OS短于DLX5低甲基化组AML患者(P=0.002及P=0.024)。在CN-AML中,DLX5高甲基化组AML患者的OS及LFS明显短于DLX5低甲基化组AML患者(P=0.003及P=0.009)。通过Cox回归多因素分析发现:DLX5高甲基化是CN-AML患者预后不良的独立影响因素(HR=2.345,P=0.025),而在非M3患者中,趋近统计学意义(HR=1.536,P=0.071)。此外,AML患者中DLX5的表达水平较对照显著下调(P<0.001),并且和DLX5甲基化呈现负相关(R=-0.306,P=0.039)。人白血病细胞株SKM-1经过DAC去甲基化处理,DLX5的mRNA呈现上调(P=0.003)。通过功能实验发现DLX5过表达后SKM-1细胞凋亡增加,细胞增殖能力下降,主要发现其细胞周期阻滞在G1期。结论MDS进展过程中全基因组发生高甲基化改变,其中包括ID4和DLX5甲基化。ID4和DLX5甲基化通过调控基因表达参与MDS疾病进展,并且可能作为MDS和AML患者预后分子标志物。