【摘 要】
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研究目的:研究粪肠球菌（Enterococcus faecalis,E.faecalis）诱导THP-1单核巨噬细胞炎症因子和炎症小体表达的情况和粪肠球菌促进MG63成骨细胞的凋亡和焦亡情况,以探讨粪肠球菌感染导致根尖周炎复发和阻碍愈合的致病能力。同时进一步研究炎症小体在粪肠球菌促进THP-1单核巨噬细胞的炎症因子表达和MG63成骨细胞凋亡中的作用,以探讨粪肠球菌促炎和促凋亡的机制。材料和方法:1
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（No.81271133）；
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研究目的:研究粪肠球菌（Enterococcus faecalis,E.faecalis）诱导THP-1单核巨噬细胞炎症因子和炎症小体表达的情况和粪肠球菌促进MG63成骨细胞的凋亡和焦亡情况,以探讨粪肠球菌感染导致根尖周炎复发和阻碍愈合的致病能力。同时进一步研究炎症小体在粪肠球菌促进THP-1单核巨噬细胞的炎症因子表达和MG63成骨细胞凋亡中的作用,以探讨粪肠球菌促炎和促凋亡的机制。材料和方法:1、在探讨粪肠球菌促炎能力和机制的实验中,（1）首先采用酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、实时聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot analysis）检测粪肠球菌在不同感染浓度和不同感染时间下导致THP-1单核巨噬细胞炎症因子和炎症小体的表达情况;（2）采用LDH细胞毒性检测试剂盒定量分析粪肠球菌感染导致的THP-1单核巨噬细胞乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的释放量;（3）然后分别采用caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK和Ac-YVAD-CHO处理、小干扰RNA（Small interfering RNA,si RNA）下调NLRP3活性以及ox ATP和高浓度KCl分别阻断P2X7R受体和胞内K+外流后检测粪肠球菌感染诱导THP-1单核巨噬细胞炎症因子的表达情况和LDH的释放情况。2、在探讨粪肠球菌促进MG63成骨细胞的凋亡和焦亡能力与机制的实验中,（1）首先采用CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit）检测粪肠球菌在不同感染浓度和不同感染时间下对MG63成骨细胞增殖的影响;（2）采用流式细胞仪和蛋白免疫印迹法分析粪肠球菌感染导致MG63成骨细胞的凋亡情况;（3）采用LDH细胞毒性检测试剂盒定量分析粪肠球菌感染导致MG63成骨细胞LDH的释放情况;（4）采用蛋白免疫印迹法检测粪肠球菌感染导致MG63成骨细胞caspase-1和NLRP3的表达情况,采用caspase-1抑制剂阻断caspase-1活性后检测粪肠球菌诱导的LDH释放量,同时采用NLRP3-si RNA下调NLRP3活性后检测粪肠球菌感染诱导MG63成骨细胞凋亡情况和LDH释放情况。3、采用免疫组织化学技术（Immunohistochemistry,IHC）、定量PCR和蛋白免疫印迹法检测炎症小体NLRP3和AIM2在慢性根尖周炎病损组织中的表达和分布情况。结果:1、粪肠球菌感染导致THP-1单核巨噬细胞炎症因子IL-1β和炎症小体NLRP3的表达增加,NLRP3活化参与IL-1β的分泌:（1）ELISA检测结果显示粪肠球菌感染诱导IL-1β分泌随着感染浓度和感染时间的增加而增加;（2）Real time PCR和Western blot检测发现粪肠球菌感染导致IL-1β、caspase-1、NLRP3表达水平也呈MOI浓度依赖性增加;（3）粪肠球菌感染也导致LDH释放量呈MOI浓度依赖性增加;（4）分别抑制caspase-1、NLRP3活性及阻断胞内K+外流后,粪肠球菌感染诱导的IL-1β表达和LDH释放均显著降低（P<0.05）。2、粪肠球菌感染诱导MG63成骨的凋亡和焦亡,这一过程也受到NLRP3炎症小体的调节:（1）CCK-8检测发现粪肠球菌感染导致MG63成骨细胞增殖抑制率显著增加,而且随着感染浓度和感染时间增加而增加;（2）流式细胞仪和Western blot检测均发现粪肠球菌感染促进MG63成骨细胞凋亡;（3）粪肠球菌感染导致LDH释放也显著增加;（4）粪肠球菌感染导致MG63成骨细胞caspase-1和NLRP3的蛋白表达水平呈MOI浓度依赖性增加,采用caspase-1抑制剂处理后粪肠球菌诱导的LDH释放显著减少（P<0.05）,采用si RNA下调NLRP3活性后粪肠球菌感染导致的细胞凋亡和LDH释放均显著减少（P<0.05）。3、免疫组织化学技术、Real time PCR及Western blot检测均发现炎症小体NLRP3和AIM2在慢性根尖周炎病损组织中的表达增加,而且主要分布在中性粒细胞、浆细胞、巨噬细胞等炎症细胞中,但是NLRP3表达增加较AIM2更显著。结论:1、通过体外研究发现粪肠球菌促进THP-1单核巨噬细胞炎症因子IL-1β的表达呈MOI浓度依赖性增加;2、粪肠球菌感染诱导THP-1单核巨噬细胞分泌IL-1β依赖于Caspase-1和NLRP3的参与;3、粪肠球菌感染诱导MG63成骨细胞凋亡和炎症性细胞死亡（焦亡）,而且细胞凋亡和焦亡的数量随着感染浓度增加而增加;4、粪肠球菌感染诱导MG63成骨细胞凋亡和焦亡依赖NLRP3的参与;5、炎症小体NLRP3和AIM2参与根尖周炎的发病过程。
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