出血性脑卒中是常见的危急重症之一,其高死亡率和高致残率在全世界范围内极大地威胁着人类健康,虽然随着近年来医疗水平不断进步情况有所缓解,但对于脑出血后的继发性脑损伤治疗效果仍不理想。脑出血后发生继发性脑损伤的机制复杂,包括神经炎症、神经元凋亡、脑水肿等一系列病理生理反应,目前国内外研究表明神经炎症与出血性脑卒中患者神经功能损伤密切相关,因此亟待探索脑出血后神经炎症的分子机制并进行针对性地干预。小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞可通过吞噬细胞碎片等方式发挥调节神经元及其轴突的生长和发育的生理作用,在疾病条件下受刺激的小胶质细胞可通过TLR样受体介导的信号通路诱发炎症级联反应恶化神经功能。既往研究表明,对小鼠进行TLR4基因敲除或给予TLR4抑制剂治疗能通过抑制小胶质细胞的活化、减少促炎性炎症因子的产生从而发挥神经保护作用。因此,了解该免疫细胞的作用机制,特别是其在脑出血损伤后神经炎症反应中的作用有助于找到应对脑出血后过度的炎症反应及其造成的不利临床后果的治疗策略。比如通过解析细胞外信号触发小胶质细胞过度活化的分子基础,并了解参与这种信号传导的分子开关从而靶向抑制炎症反应改善预后。然而小胶质细胞参与调控神经炎症反应的机制还存在许多尚未明确的问题,这在一定程度上限制了基于靶向干预小胶质细胞的神经炎症反应实现临床治疗策略的发展。对出血性脑卒中期间小胶质细胞的作用机制进行深入研究,有助于探索神经炎症过程的分子,进而改善出血性脑卒中患者的预后。生物体细胞内的大多数mRNA前体在细胞核内进行转录后转运到细胞质中的特定位置进行加工从而产生成熟的mRNA,这一过程与其编码的蛋白质的翻译相匹配。成熟的mRNA必须定位到特定的位置才能发挥功能,如果mRNA在细胞核-质位置上的定位产生偏差,将会导致细胞的多种生命活动受影响,甚至对细胞的生命造成威胁。有研究观察到人类大脑发育过程中的RNA核保留现象并合理预测RNA在细胞核中错误定位可能与大脑发育失调疾病,如神经精神类疾病密切相关。此外,一些重要的分子生物学过程,如基因表达调控、蛋白质合成等过程都依赖于mRNA在细胞核-质位置上的动态变化。既往研究发现,成熟的mRNA在特定亚细胞水平的异常累积是一些神经退行性病变的关键致病因素之一。例如编码肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）的致病蛋白ALS相关蛋白TDP-43的mRNA在正常情况下定位在运动神经元细胞核但在ALS病人中错误地出现在细胞质并出现其蛋白团块积聚的病理改变。随着测序技术的发展,在出血性脑卒中领域对于多种细胞转录的研究也越来越细致,然而,目前的研究大多关注于细胞整体水平的转录组变化,对疾病状态下mRNA在亚细胞水平上的表达特征及功能却知之甚少。因此,为了更好地了解小胶质细胞细胞核-质RNA在脑出血后神经炎症发生发展中的作用,对这些细胞核-质差异基因进行全局剖析十分重要。本研究分为三个部分展开探讨。第一部分使用氧合血红蛋白（oxyhemoglobin,oxy-Hb）刺激小胶质细胞BV2旨在体外模拟脑出血后血肿成分刺激小胶质细胞导致的神经炎症,在该模型上实现细胞核-质亚细胞成分分离效果评估并验证炎症因子在亚细胞水平上的表达情况。第二部分利用全转录组测序技术结合生物信息学分析进一步研究细胞核-质差异基因在小胶质细胞神经炎症微环境中的作用。第三部分研究基于全转录组测序数据进一步分析细胞质和细胞核内的mRNA可变剪接事件,旨在揭示炎症基因参与神经炎症微环境的机制。1基于小胶质细胞神经炎症模型亚细胞组分分离方法的效果评估目的:分离出高纯度的细胞质与细胞核组分,并提取RNA和蛋白质进行实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、RNA测序文库构建、蛋白质印迹法（Western blotting,WB）等后续实验。方法:1.在正常培养的小胶质细胞系BV2培养基中加入浓度为10uM的氧合血红蛋白（oxy-Hb）,继续培养12小时或24小时,对照组（control）不加入oxy-Hb。2.通过显微镜观察小胶质细胞激活后的形态变化,用细胞增殖及细胞毒性检测法评估细胞活力,通过一氧化氮（NO）释放量检测NO产生情况,以及RT-qPCR检测小胶质细胞M1型和M2型激活标志物以及炎症因子的表达情况。3.对control组、oxy-Hb刺激12h及24h组小胶质细胞分别分离出细胞核和细胞质成分,利用DAPI染色、Western blotting以及RT-qPCR技术检测定位于细胞核或细胞质的蛋白质和RNA以评估亚细胞组分分离效果。结果:1.与control组相比较,oxy-Hb刺激后小胶质细胞形态上变化成典型阿米巴样激活形态,细胞活力随时间点逐渐减少（P<0.05）,而NO的释放量则显著增加至12小时达顶峰（P<0.01）,24小时有轻微降低。在mRNA水平上,药物处理组炎症因子（TNF-α、Il-1β和Il-6）以及M1促炎型小胶质细胞标志物CD16的表达量明显增加（P<0.01）而M2抑炎型小胶质细胞的标志物CD206和arg1的表达于刺激后明显降低（P<0.001）。2.成功分离出高纯度的细胞核及细胞质组分。通过DAPI染色观察到细胞核组分中胞核完整无破损。利用Western blotting和RT-qPCR技术检测定位于细胞核的蛋白质（Histone H3）和RNA（MALAT1）仅在细胞核组分中表达（P<0.05）。同样地,定位于细胞质的蛋白质（a-Tublin）和RNA（tRNA-Met-CAT）仅在细胞质组分中检测到（P<0.05）。3.通过RT-qPCR检测到关键炎症因子TNF-α、I-l1β和Il-6在亚细胞水平上的差异表达情况。结论:该部分研究成功使用oxy-Hb造成小胶质细胞的损伤和激活,并分离出高纯度的小胶质细胞的细胞核和细胞质组分,进一步研究发现TNF-α、I-l1β和Il-6转录本在细胞核和细胞质的差异性表达模式,提示细胞核和细胞质基因对于小胶质细胞神经炎症贡献的不同。2细胞核和细胞质差异基因在神经炎症微环境中的作用研究目的:为进一步研究oxy-Hb诱导的小胶质细胞神经炎症进展过程中细胞核-质RNA的特征,本部分研究使用全转录组测序技术对细胞核和细胞质的文库进行测序,结合生物信息学分析细胞核-质差异基因的动态变化特征及功能。方法:1.通过前述方法获取小胶质细胞的细胞质和细胞核成分,抽提RNA后评估RNA质量。2.投入起始模板量为500ng的RNA使用rRNA去除法构建文库进行第二代测序,使用Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析仪和Qubit 3.0仪器进行质量控制检测。经过检验浓度与片段大小均符合上机要求的文库在Illumina HiSeq 1500系统上进行双端测序。3.将测序下机数据进行清洁处理、基因组比对、过滤和归一化处理,使用TPM值表示基因的表达情况。使用DESeq2软件计算基因表达差异,差异表达基因的选择标准:选取变化倍数（Foldchange）的绝对值|log2Foldchange|>1 和经过 FDR（False Discovery Rate,错误发现率）校正过后的P值<0.05的值,认为是有差异表达的基因。4.使用R语言clusterProfiler软件包对经筛选符合标准的差异表达基因进行GO（Gene Ontology,基因本体）富集分析与KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因和基因组百科全书）通路富集分析。结果:1.通过PCA主成分分析和斯皮尔曼相关性分析评估文库质量以及样品重复性,并排除批次效应。2.细胞核-质差异表达基因的数量随着小胶质细胞发生神经炎症的时间进展逐渐减少。3.炎症早期（oxy-Hb刺激12小时）细胞核-质差异表达基因数量分别占比该时间点差异表达基因总数的37.54%与62.46%,细胞核差异表达基因在12小时的高占比现象提示其在炎症早期重要的生物学功能。4.通过功能富集GO分析发现主要参与炎症反应相关通路的基因在细胞质内,而非细胞核。结论:这部分结果揭示了细胞核-质差异基因随着炎症时间的进展逐渐趋于平稳的表达模式,说明了在炎症早期转录本的敏感性更高。细胞核富集的基因在早期（12小时）神经炎性过程中的高占比提示细胞核基因在此过程的重要调控作用。在oxy-Hb诱导小胶质细胞炎症微环境中参与炎症反应通路相关基因主要富集在细胞质,说明保留在细胞质的差异基因是维持炎症微环境的重要力量。3可变剪接事件在出血诱导的小胶质细胞炎症微环境中的作用研究目的:该部分研究基于RNA-seq数据分析细胞质和细胞核的可变剪接事件。方法:使用rMATs软件统计模型检测小胶质细胞神经炎症模型中细胞核和细胞质发生的可变剪接事件。结果:1.与对照组相比,可变剪接事件在小胶质细胞炎症微环境中呈现出细胞质或细胞核偏好性分布的特点,其中内含子保留事件主要发生于细胞核的基因中,外显子跳跃事件则倾向于发生在细胞质的基因中。2.发生内含子保留事件细胞核基因的功能与炎症的持续时间相关,在炎症12小时细胞核内发生差异性内含子保留事件的基因主要富集在非编码RNA（ncRNA）的加工和代谢过程、核蛋白复合体生成以及组蛋白的去乙酰化修饰等生物过程。而24小时发生特异性内含子保留事件的细胞核基因显著富集在蛋白质的细胞核定位、组蛋白甲基化修饰和细胞核-质转运等生物学过程。结论:此部分结果揭示了小胶质细胞神经炎症伴随着广泛的异常mRNA可变剪接事件的发生,且mRNA可变剪接事件在细胞核-质之间存在偏好性,其中外显子跳跃事件主要发生在细胞质基因中,内含子保留事件主要发生在细胞核基因中。此外,在细胞核内发生内含子保留事件的基因在炎症12小时主要功能是与核蛋白复合体生成和表观遗传学修饰如非编码RNA加工和组蛋白修饰,在炎症24小时主要为蛋白质的核定位、组蛋白修饰和核质转运。