目的:棒曲霉素(Patulin,PAT)是一种由青霉属、曲霉属和丝孢霉属的真菌产生的聚酮化合物内酯(4-羟基-4H-呋[3,2-c]吡喃-2(6H)-酮),通常存在于苹果及其衍生产品中,容易对人类健康造成危害。PAT可通过吸入、摄入和皮肤接触进入机体,具有遗传毒性、胚胎毒性、免疫毒性和致畸性。大量研究表明,肾脏、肝脏、胃肠道和免疫系统是哺乳动物PAT毒性的主要靶器官,但PAT引起毒性的分子机制仍不十分清楚。近年来,研究表明细胞自噬和凋亡之间存在密切关联,过程涉及细胞内蛋白质和细胞器的转化和降解。很多研究表明自噬的发生先于细胞凋亡,自噬可以直接诱导细胞凋亡。本实验中,我们以HepG2细胞为研究对象,检测PAT作用后,是否可引起HepG2细胞的自噬和凋亡,并探究两者之间的相互关系。方法:用2μM的PAT在不同时间点(0、3、6、12、24 h)处理HepG2细胞,用Western blot(蛋白质免疫印迹)法检测HepG2细胞LC3-Ⅱ、组织蛋白酶B、细胞色素c、caspase 3等各种相关蛋白表达水平的变化情况;用AO染色重新定位法,通过荧光显微镜(Olympus BX-63)检测PAT对HepG2细胞溶酶体膜稳定性的影响;用JC-1染色法,使用荧光显微镜检测PAT对HepG2细胞线粒体跨膜电位的影响;用Hoechst染色和流式细胞术检测PAT是否诱导HepG2细胞凋亡;用RNA干扰法敲减Atg5基因,或用自噬抑制剂3MA(1 mM)处理后,检测在PAT处理的HepG2细胞中,自噬与溶酶体膜通透性增加(Lysosomal membrane permeabilization,LMP),线粒体膜通透性增加(Mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP)和细胞凋亡之间的关系;用组织蛋白酶B的特异性抑制剂CA-074 Me(10μM)处理后,使用荧光显微镜和Western blot法检测组织蛋白酶B对PAT诱导的MOMP和细胞凋亡的影响。结果:用2μM PAT分别处理细胞0、3、6、12、24 h结果发现,处理6 h后,细胞LC3-II蛋白的表达水平明显升高,用氯喹处理细胞后,可促进LC3-II的积累。PAT处理细胞12 h后,LMP水平显著增加,同时发现组织蛋白酶B的释放量和表达水平也随之增加;加入3MA预处理,发现LMP的增加和组织蛋白酶B的表达水平显著下降。同时检测到细胞在PAT处理12 h后,线粒体膜电位(Inner mitochondrial membrane potential,ΔΨm)显著降低,细胞色素c的释放量和表达水平也随之增多;与上述处理类似,加入特异性抑制剂3MA和CA-074 Me预处理,发现ΔΨm水平增高,细胞色素c的释放水平明显下降。Hoechst染色和流式细胞术结果显示,HepG2细胞在持续接触PAT的12 h后开始发生凋亡,Western blot结果显示,caspase 3蛋白表达水平在PAT处理12 h开始显著升高;加入3MA,siRNA Atg5和CA-074 Me预处理后,细胞凋亡情况有所缓解。结论:PAT诱导HepG2细胞自噬依赖性凋亡,PAT可早期激活自噬,进而引起LMP增加和ΔΨm降低,通过溶酶体-线粒体轴,最终导致HepG2细胞凋亡。