论文部分内容阅读
DNA拓扑异构酶Ⅰ(topoisomerase Ⅰ,TOP1)是一类通过介导DNA的断开/重连(breakage/Religation)机制而催化DNA在不同拓扑异构结构下相互转换的核酶,它参与调控DNA代谢相关的分子过程:DNA复制,RNA转录等。植物来源的抗癌生物碱喜树碱(Camptothecin,CPT)在体内的作用位点是TOP1。它通过插入DNA链的方式阻止TOP1-DNA切口的重连,导致体内累积大量的CPT-TOP1剪接复合体(CPT-TOP1 cleavage complex)而引起DNA损伤,最终导致细胞死亡和细胞周期紊乱。在拟南芥中,TOP1有两个同源基因TOP1α和TOP1β。top1α突变导致花序分生组织紊乱,根干细胞出现死细胞,但是top1β突变却没有表型。这两个同源基因的功能差异并不清楚。根干细胞的死亡机理和两个基因的表达模式有待阐明。CPT在拟南芥体内的靶位点需要确认。本文的主要结果如下:1.构建了TOP1α和TOp1β的报告基因株系,发现两个基因的表达模式是一样的,而且TOP1β的蛋白融合能互补top1α突变表型,而且功能有冗余却有差异。2.top1α突变体根分生区变短导致根伸长缓慢。3.CPT在根干细胞导致的表型和top1α突变体表型一致。CPT在整个分生区诱导DNA损伤,但是在分生区导致G2期毒性,在干细胞区导致S期毒性所致的细胞死亡;分生区细胞对CPT毒性的应答依赖于ATM/ATR/WEE1途径。top1α突变体只在干细胞区死亡细胞区域导致DNA损伤,和S期依赖的细胞死亡。一系列与细胞周期相关的基因(包括CYCB1;1,WEE1等)在CPT时间梯度处理后发生动态变化,表明CPT在根尖导致S期和G2期紊乱。4.TOP1α在保守抗性位点的点突变N871S导致很强的CPT抗性,结合表型证据和细胞周期基因的分析,表明TOP1α是CPT在拟南芥体内的靶位点。5.CPT诱导和top1α突变都导致ERF115和WOX5基因的上调表达,ERF115在根干细胞的死细胞临近的干细胞表达。ERF115表达出现在死细胞后,早于WOX5的表达上调,表明CPT诱导和top1α突变诱导干细胞化,以补给干细胞的死亡和维持干细胞小生境。6.CPT通过抑制TOP1α介导的H3K27me3组蛋白修饰标记的水平而调控ERF115和WOX5基因的转录。7.组蛋白H3K27去甲基化酶抑制剂抑制GSK-J4抑制CPT诱导的ERF115和WOX5基因的上调表达,证明H3K27me3等表观修饰在调控干细胞化基因表达中的功能。8.GSK-J4抑制幼苗根的CPT毒性的恢复,表明两个药物联合处理能有效清除干细胞化。