论文部分内容阅读
研究背景:随着显微外科技术和免疫药物的研究进展,异体复合组织移植给严重体表创伤患者带来了新的希望,然而其术后急性排斥反应仍然是亟需解决的重大难题。目前对急性排斥反应的治疗采用大剂量激素联合免疫抑制剂,但其带来的机会性感染、肿瘤、糖尿病等副作用,制约了异体复合组织移植临床推广。近年来,细胞移植治疗联合低剂量免疫抑制剂方案在诱导免疫耐受的研究中已显示出良好的应用前景,而且,在多种动物模型及人体器官移植中采用供体特异性输注(donor-specific transfusion,DST)已成功诱导了免疫耐受,其机制包括克隆无能、活化诱导T细胞凋亡(activation-induced cell death,AICD)、免疫调节作用等,其中白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)介导的AICD和诱导调节性T细胞(Regulatory T Cell,Tregs)是外周耐受的重要环节。同种异体移植后急性排斥反应的主要过程是效应细胞介导的免疫应答,其中涉及T细胞的活化以及相关因子的释放,而在急性排斥期输注供体细胞能否发挥免疫调节作用,抑制免疫效应细胞的活化,从而降低免疫排斥强度,对此还未进行广泛研究。本研究拟采用减量免疫抑制剂诱发急性排斥反应模型研究供体脾细胞静脉输注,对同种异体小鼠皮片移植后发生急性排斥反应的影响,探索这一细胞移植策略能否降低急性排斥反应的强度并有效减少免疫抑制剂的用量,为细胞移植用于治疗同种异体移植急性排斥反应提供实验依据。目的:1.研究在急性排斥期静脉输注供体脾细胞联合减量注射环孢素A(Cyclosporine,Cs A)的方法对异体小鼠皮片移植后发生急性排斥反应的影响;2.初步探索供体细胞输注对调控受体急性免疫排斥反应的相关分子机制。方法:1.建立免疫抑制剂减量诱导小鼠同种异体排斥反应的最适方案。选择Babl/c小鼠为供体,C57BL/6小鼠为受体,进行小鼠异体皮片移植。1)探索C57BL/6小鼠的Cs A耐受剂量。受体C57BL/6小鼠随机分为3组,每组6只,分别为Ⅰ组:移植术后Cs A50 mg/kg/day腹腔注射,直至皮片排斥;Ⅱ组:30 mg/kg/day腹腔注射,直至皮片排斥;Ⅲ组20 mg/kg/day腹腔注射,直至皮片排斥。术后记录体重变化、死亡率、皮片存活时间(皮片80%面积坏死为排斥终点)。2)探索诱导急性排斥反应的Cs A减量方案:受体C57BL/6小鼠随机分为3组,每组8只,均接受Babl/c小鼠的异体皮片移植,分组如下:A1组(移植皮片后给予Cs A30 mg/kg/day腹腔注射,直至皮片排斥),B1组(移植皮片后给予Cs A30 mg/kg/day腹腔注射,第10天减量至15 mg/kg/day),C1组(移植皮片后不给予任何处理),术后比较3组皮片存活时间,术后3、7、11天进行移植皮片病理学HE染色,参照Banff分级标准,判断其病理分级。统计学方法:皮片存活时间两两比较采用SNK-q检验,两组率的比较采用student-t检验,P≤0.05为两组间差异有统计学意义。2.实验观察供体脾细胞输注对免疫抑制剂减量诱导急性排斥反应的免疫调控的作用。96只受体C57BL/6小鼠随机分为A2组(阳性对照组:Cs A腹腔注射)、B2组(实验组:静脉注射供体脾细胞+Cs A腹腔注射)、C2组(假手术组:静脉注射生理盐水+Cs A腹腔注射)、D2组(阴性对照组:仅进行异体皮片移植),每组24只。各组小鼠均接受Babl/c小鼠异体皮片移植。Cs A注射方法为:Cs A30 mg/kg/day腹腔注射,第10天Cs A减量至15 mg/kg/day。细胞或生理盐水输注均在植皮后第7天进行。术后对比各组皮片存活时间,SNK-q检验比较各组之间的差异,P≤0.05为两组间差异有统计学意义。术后第11天取各组小鼠移植皮片行病理HE染色以评估免疫排斥病理分级。3.探索供体脾细胞输注调控受体急性排斥免疫反应的相关机制。利用荧光定量PCR检测上述实验各分组受体小鼠术后第1、4、7、8、10天脾脏IL-2 m RNA变化及第11天脾脏IL-10、转化生长因子β(Transforming growth factor,TGF-β)m RNA水平,第8、10、15天行流式检测各组小鼠脾细胞调节性T细胞(Tregs)比例变化。两组率的比较采用student-t检验,P≤0.05为两组间差异有统计学意义。结果:1.1)Cs A50 mg/kg/day腹腔注射组6只小鼠在术后3-5天体重下降,在5天内全部死亡,Cs A30 mg/kg/day腹腔注射组小鼠体重变化无明显变化,且皮片存活时间为18.4±0.5天,较Cs A20 mg/kg/day组(15.4±0.4天)延长3.0天,差异具有统计学意义(P≤0.05);2)A1、B1组移植皮片存活时间分别为18.5±0.52天、11.12±0.4天,A1组较B1组延长7.34天,差异具有统计学意义(P≤0.05);对照皮肤排斥病理分级,C1组术后第7天为Ⅰ级,A1、B1组为0级。2.B2、C2组的移植皮片平均存活时间分别为14.3±1.02天、11.12±0.35天,B2组较C2组延长3.18天,差异具有统计学意义(P≤0.05)。第11天病理HE染色示A2、B2组病理分级为0级,而C2、D2组为Ⅲ级。3.B2组小鼠脾脏调节性T细胞比例在第8天到第10天有明显升高的变化,其余各组无明显变化。对比第10天脾脏调节性T细胞比例,B2组较C组高,差异具有统计学意义(P≤0.05)。B2组小鼠脾脏IL-2 m RNA在第7到8天有明显的升高,其余各组无明显变化。对比第11天脾脏IL-10、TGF-βm RNA的比值,B2组较C组高,差异具有统计学意义(P≤0.05)。结论:急性反应期静脉输注供体脾脏细胞,能增加脾脏调节性T细胞数量,提高抑制性细胞因子IL-10、TGFβm RNA水平,从而显著延长同种异体皮片移植物存活时间。