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肾小球是肾的滤过单位,各种原发或继发肾小球疾病均能引起肾小球功能失常,肾小球系膜细胞(Human mesangial cell,HMC)、内皮细胞、上皮细胞参与了大多数病理过程。在肾小球疾病的发生和发展过程中系膜细胞作用很关键。在炎症、免疫复合物等病理因素刺激下,系膜细胞活化,表现出活跃的增殖状态,导致系膜区增宽、毛细血管拌受压、蛋白质滤过增加、肾小球滤过率下降。抑制系膜细胞过度增殖是治疗肾炎,防止肾小球硬化的关键环节。虫草多糖是冬虫夏草中提取出来的活性物质,具有抗氧化,免疫调节,消炎,降血糖等作用,因而具有良好肾脏保护作用。本研究在体外培养的系膜细胞基础上探讨虫草多糖抑制细胞细胞增殖的可能的作用机制,为虫草多糖延缓慢性肾小球肾炎疾病进展提供依据。 一、虫草多糖活性片段的制备及检测 以实验室分离得到的酸性虫草多糖(CPS2)为原料,在体外模拟的人工胃液中水解12h,得到虫草多糖活性片段,分析其分子量及单糖组成,并采用MTT法筛选其作用浓度。结果显示:酸性虫草多糖经人工胃液水解12h得到的样品是相对分子质量为2.38×104Da,纯度为98.75%的纯净多糖,是含葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖的杂多糖。 二、MTT法检测虫草多糖对PDGF-BB诱导的HMC细胞增殖的影响 采用MTT法筛选PDGF-BB造模、CPS-F最佳的工作浓度以及CPS-F对PDGF-BB诱导下HMC增殖的影响。结果显示:PDGF-BB最佳浓度为50ng/ml;CPS-F单独作用正常HMC时对细胞增殖影响不大,但在200μg/ml时有一定药毒性;CPS-F作用于PDGF-BB诱导的HMC时,在25μg/ml即有统计学意义(*P<0.05),浓度为50μg/ml极显著差异(##P<0.01)。提示CPS-F可抑制PDGF-BB诱导的HMC增殖,而对正常HMC作用不明显。 三、采用Western blot及流式细胞术分析对细胞周期的影响 运用不同浓度的CPS-F(25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)作用于PDGF-BB诱导的HMC细胞,采用Western blot技术检测其周期蛋白(CDK-4、cyclinD1)表达水平,并利用流式细胞仪检测其对细胞周期进程的影响进行观察。结果显示:CPS-F可显著抑制CDK-4、cyclinD1蛋白表达水平,但其对细胞周期进程的影响不大。 四、观察虫草多糖对系膜细胞自分泌因子(TNF-α、MCP-1)的影响 采用Western blot,检测不同浓度的CPS-F对PDGF-BB诱导细胞自分泌的炎症因子的标志物(TNF-α、MCP-1)的影响。结果显示:各浓度虫草多糖(25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)均可显著抑制PDGF-BB诱导的HMC细胞炎症因子的释放。 通过上述研究,证实了CPS-F可以抑制PDGF-BB诱导的系膜细胞增殖,可降低PDGF-BB诱导下HMC自分泌蛋白(TNF-α、MCP-1)的表达,表明CPS-F抑制PDGF-BB引起的HMC增殖,可能是通过阻止PDGF-BB对HMC的损伤刺激。