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目的1.研究细胞周期正调控因子p27Kip1的磷酸化在肝细胞肝癌中的表达与临床病理和预后的关系,初步探讨p27Kip1的磷酸化在肝细胞肝癌中的重要意义;2.运用PI3K抑制剂LY294002对肝癌SMMC-7721细胞的影响及与p-p27kip1 Thr157分子网络的关系,初步探讨p27kip1分子磷酸化在肝细胞肝癌发生机制过程中的作用。3.构建pEGFP-p27wt和pEGFP - p27Kip1 (T198A)突变质粒,为下一步转染HCC细胞株分析突变后对p27kip1的降解、亚细胞定位及生物学功能的影响奠定了实验基础。方法1.我们研究p27Kip1的157号位苏氨酸磷酸化在肝细胞肝癌中的表达,对51例肝癌组织石蜡切片进行免疫组织化学分析和对8例新鲜冰冻组织进行Western blot分析。检测p-p27kip1 Thr157与肝细胞肝癌的临床病理及其预后之间的关系。然后进一步观察p27Kip1的198号位苏氨酸磷酸化在肝细胞肝癌中的表达情况。2.我们运用CCK-8和流式细胞仪检测肝癌细胞用PI3K抑制剂LY294002处理后的增值和细胞周期的变化;Western blot分析p27Kip1表达变化和定位情况。3.人类野生型p27Kip1是通过寡核苷酸引物(5’CGAGATCTGATGTCAAACG TGCGAGT 3’和5’CT GAATTC TTGACGTCTTCTGAGGCC 3’) PCR扩增,然后克隆到质粒pEGFP-N2的Bgl II-EcoRI位点,产生pEGFP- p27Kip1wt载体。而p27Kip1的198号位苏氨酸突变为丙氨酸p27Kip1 (T198A)是运用重叠(序列)延伸PCR技术使突变位点转到野生型的p27Kip1上,其引物是5’CTCTCGAGGATGTCAAACGTGCGAGT 3’and 5’CGGAATTCTTTGACGTCTTCT GAGGCC 3’。pEGFP-p27wt和pEGFP - p27Kip1 (T198A)都被插入载体pcDNA3.1/myc-His的XhoI/EcoRI位点。最后测序确定质粒克隆的准确性。结果1. 51例免疫组化分析发现p-p27kip1 Thr157和KI67的表达呈正相关(r=0.161;p<0.05);p-p27kip1 Thr157是与肝癌患者肿瘤病理分级相关的(P=0.043),而Ki67的表达强度与患者血清AFP水平、坏死程度、肿瘤病理分级以及转移相关,P值分别为0.035、0.040、0.004、0.049。Kaplan-Meier分析发现p-p27kip1 Thr157和KI67的表达与肝癌患者的预后相关。进一步观察到p-p27kip1 Thr198在HCC中高表达,表达在细胞核和(或)胞浆中,p-p27kip1 Thr198在非癌组织中几乎无表达。2.本研究中PI3K抑制剂LY294002明显地抑制肝癌细胞的增殖,而且呈剂量依赖性,这个过程是通过p27来实现的,而p21,p16等其它抑癌因子在此过程中没有表达变化;同时核浆分离Western blot检测p27在核内聚集。3.成功得构建pEGFP-p27wt和pEGFP - p27Kip1 (T198A)质粒。结论1. P-p27kip1 Thr157可能是肝细胞肝癌的重要的预后指标。2.在临床上PI3K抑制剂LY294002可能可以作为肝癌化疗的一种药物; PI3K抑制剂LY294002发挥抑制增殖的作用可能是通过调控p27kip1表达和定位来实现的。