论文部分内容阅读
糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer,DFU)是一种危害巨大且治疗费用高昂的糖尿病并发症,约15-25%的病人因此截肢,严重危害患者生命安全和生活质量。DFU容易合并感染,感染是阻碍创面愈合的重要因素。抗生素是控制DFU感染的常用手段,但由于频繁使用抗生素引起的细菌耐药导致单纯使用抗生素效果不理想。因此,探索新的干预措施来对抗DFU感染及促进创面修复具有重要意义。近年来,富血小板凝胶(platelet-rich gel,PRG)开始被用于治疗DFU,展现出了良好的抗感染和促进愈合作用。PRG是由富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)经过凝血酶和(或)钙剂激活后形成。PRG中受到激活的血小板所释放的活性物质参与了其功能的发挥。由于PRG不容易引起耐药,与抗生素同时使用时有协同作用,这种多重特性使其独具优势,已成为一种新的治疗DFU的有效手段。PRG中血小板所释放的抗菌肽、趋化因子、补体、过氧化物等物质可以直接抑制或杀灭病原体,或通过趋化和激活免疫细胞发挥抗菌作用。研究证实PRG在体外对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌等多种细菌均有抑制作用。S.aureus是皮肤常居菌,皮肤损伤后很快在创面定殖,是DFU主要的感染源之一。角质形成细胞是构成表皮结构最主要的细胞,在创伤和感染发生时角质形成细胞通过吞噬细菌,分泌多种免疫介质和细胞因子参与皮肤免疫反应。在创面愈合过程中角质形成细胞增殖、迁移和分化,实现再上皮化过程使创面达到愈合。因此,研究S.aureus和角质形成细胞的相互作用对于认识皮肤的抗感染和修复机制具有帮助,但既往研究多从抗菌角度出发观察PRG在体外对S.aureus生长的抑制作用,而PRG如何帮助角质形成细胞对抗S.aureus感染尚不清楚。除了具有生物抗菌素的作用,PRG还能显著促进创面愈合。既往研究提示PRG中高浓度的血小板所释放的多种生长因子在加速创面愈合进程中协调发挥作用。近来研究还发现血小板可以表达超过200种的microRNA,呈高丰度表达的包括miR-223、miR-26、miR-23和miR-21等,其中miR-21与创面愈合直接相关。有研究报道miR-21是皮肤创面修复过程中的促愈和分子,因此我们推测miR-21可能在PRP治疗DFU中具有重要作用,但是具体机制尚不明确。细胞程序性细胞死亡因子4(programmed cell death factor4,PDCD4)是一种调控细胞生长和凋亡的分子,PDCD4在转录后水平接受miR-21的调控。有研究报道PDCD4能够影响NF-κB信号通路活性,而NF-κB信号通路在炎症反应中发挥重要调控作用。据此,我们推测PRG可能通过miR-21调控PDCD4进而影响NF-κB活性,调节DFU创面处紊乱的炎症反应从而促进创面愈合。为探究上述问题,我们将永生化的人角质形成细胞(HaCaT细胞)与S.aureus在高糖环境下共培养建立体外感染创面模型。然后在该模型中采用PRP、PRG或富血小板凝胶萃取液(extract liquid of platelet-rich gel,EPG)进行干预,观察各种干预物质对HaCaT细胞和S.aureus生长的影响,探索干预前后HaCaT细胞内miR-21和PDCD4的表达变化、NF-κB信号通路的活性改变以及炎症相关细胞因子水平的变化,旨在评估不同形式血小板制品的抗菌能力和对细胞的保护作用,揭示miR-21在PRG促进DFU愈合中发挥作用的可能机制。第一部分富血小板凝胶在体外高糖感染创面模型中的抗菌及促细胞增殖作用研究目的:建立高糖环境下的体外感染创面模型从而模拟DFU中受S.aureus感染的角质形成细胞,并研究PRP、PRG及EPG对S.aureus的抗菌作用和对HaCaT细胞增殖的影响。方法:将HaCaT细胞与S.aureus在高糖环境下共培养建立体外感染创面模型,检测不同浓度S.aureus对细胞增殖的影响。以贫血小板血浆(platelet-poor plasma,PPP)干预本模型为对照,实验组分为PRP干预组、PRG干预组和EPG干预组。通过平板菌落计数法对干预后不同时间点各组中活菌进行计数,比较不同干预物对S.aureus生长的影响。采用CCK8法检测单纯细胞培养组,细胞与细菌共培养组及EPG干预组中HaCaT细胞的增殖情况。结果:(1)S.aureus与HaCaT细胞共培养导致细胞增殖显著下降(P<0.05),下降程度随细菌浓度增加和共培养时间延长而加重,与细菌共培养48小时后导致细胞损失殆尽。(2)同PPP组相比,PRP、RPG和EPG组在24 h内均能显著降低细胞外S.aureus数量(P<0.05);PRG和EPG在48小时内对S.aureus的抑制程度强于PRP;干预至72小时,PRG组细胞外S.aureus数量显著低于EPG组(P<0.05)。(3)EPG对S.aureus的抗菌能力与其浓度呈正相关,同PPP组相比,EPG组能够显著降低细胞内S.aureus数量(P<0.05)。(4)同单纯细胞培养组相比,采用20%的EPG干预本模型后在24小时内未见HaCaT细胞增殖显著下降(P>0.05),在接下来的24小时内可见细胞增殖显著增加(P<0.05)。20%的EPG干预未受感染的HaCaT细胞后在36和48小时可见细胞增殖显著增加(P<0.05)。结论:S.aureus感染导致HaCaT细胞增殖受损,损伤程度与细菌浓度和共培养时间呈正相关。PRG和EPG较PRP对S.aureus的抗菌能力更强,PRG较EPG作用时间更持久,但EPG作为液体便于精确使用,在48小时内更适合用于微量实验操作。作为PRG的有效成分,EPG能够显著抑制细胞内外S.aureus生长,保护HaCaT细胞对抗S.aureus感染并促进细胞增殖。第二部分富血小板凝胶在体外高糖感染创面模型中的抗炎机制研究目的:DFU是常见的难愈合性创面之一,持续不退的炎症状态是阻碍创面愈合的原因之一。有研究显示mi R-21是皮肤创面修复过程中的促愈和分子,受mi R-21调控的靶分子PDCD4可以正性调节NF-κB信号通路活性从而影响炎症反应。但mi R-21在PRG治疗DFU中如何发挥作用尚不清楚,因此本研究在已建立的体外感染创面模型中采用EPG进行干预,探索mi R-21在其中的作用及其促创面愈合的可能机制。方法:将高糖环境下培养的Ha Ca T细胞分为单纯细胞培养组(H组),细胞与细菌共培养组(HS组),受EPG干预的共培养组(HSP组)和EPG直接干预细胞组(HP组)。在不同时间点检测各组Ha Ca T细胞内mi R-21、PDCD4及磷酸化p65(p-p65)表达水平、p65在细胞内定位以及炎症相关细胞因子IL-6、TNF-α、IL-10的表达和分泌。结果:(1)同H组相比,HS组中Ha Ca T细胞内PDCD4和p-p65表达显著上调(P<0.05),p65从细胞浆向细胞核内转移,细胞表达和分泌IL-6和TNF-α显著增加(P<0.05),IL-10显著减少(P<0.05)。(2)同HS组相比,HSP组中PDCD4和p-p65的表达显著下调(P<0.05),p65向细胞核转移减少,细胞表达和分泌IL-6和TNF-α水平显著下降(P<0.05)。(3)同H组相比,HP组中Ha Ca T细胞内mi R-21水平在24和48小时显著上调(P<0.05),伴随有PDCD4和p-p65表达的显著下调(P<0.05)以及IL-6和TNF-α水平显著下降(P<0.05)。结论:S.aureus感染导致Ha Ca T细胞内NF-κB信号通路激活,刺激细胞表达和分泌促炎细胞因子。EPG可以通过其抗菌作用减少来自细菌的刺激从而发挥抗炎作用,也可以通过mi R-21负性调控PDCD4进而抑制NF-kb信号通路活性直接发挥抗炎作用。抑制创面炎症是PRG促进DFU愈合的途径之一,mi R-21作为一个干预靶点可能为DFU等难愈性创面的防治提供新的策略。