血吸虫病仍然是一种严重影响人类健康和社会经济发展的重大传染性疾病。据统计,2006年全球有2亿多血吸虫感染者;而到2014年,全球感染人数增至2.3亿。我国仅有日本血吸虫病流行,日本血吸虫虫卵沉积在肝脏引起的肉芽肿和纤维化病变是血吸虫病的主要病理改变,但其致病机制复杂,仍有很多不明确。肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSC)是包括血吸虫病肝纤维化在内的多种肝纤维化疾病的主要效应细胞。静止型的HSC在各种病理因素作用下可转分化为肌成纤维细胞,分泌大量胶原蛋白,沉积在肝组织引起肝纤维化,抑制HSC的激活是预防和治疗肝纤维化的重要途径。microRNA(miRNA)是一类含有21-23个碱基的内源性非编码单链RNA分子,广泛存在于动植物体内,在转录和转录后水平调控基因的表达,在多种疾病的发生、发展和转归中发挥着重要的调控作用。我们实验室之前发现血吸虫感染使一些宿主miRNA(如miR-21、miR-351、miR-203等)的表达上调,并调控HSC活化和血吸虫病肝纤维化的发生发展。近来研究表明,来源于植物或病原体的miRNA能够以跨界或跨物种方式调控宿主细胞基因的表达和表型。日本血吸虫为真核生物病原体,具有大量miRNA(本文简称为“虫源sja-miRNA”)。研究已显示,在日本血吸虫感染过程中,这些虫源sja-miRNA能分泌到宿主的体液中或通过外泌体(exosomes)等方式进入宿主细胞以跨物种方式调控宿主细胞基因或表型。本课题研究内容是基于本实验室项目的科学问题:日本血吸虫虫卵沉积在肝脏中,虫卵内的活毛蚴能分泌或通过外泌体携带虫源sja-miRNA至邻近的宿主细胞,包括进入HSC,调控其活化及肝纤维化的发生发展。本实验室前期已就此开展了研究,通过测序和荧光定量PCR(qPCR)鉴定发现了一些来自日本血吸虫的miRNA能进入宿主细胞,并阐明了Sja-miR-2162可以调控宿主肝纤维化的发生发展及其机制。本课题在此基础上开展了以下两方面的研究:(1)通过高通量测序和qRCR的方法对日本血吸虫感染小鼠过程中进入HSC的虫源sja-miRNA进行系统鉴定;(2)探索虫源Sja-miR-1在血吸虫病肝纤维化过程中的作用和分子机制。结果如下:1.日本血吸虫感染小鼠HSC中虫源sja-miRNA的鉴定:为了鉴定在日本血吸虫感染的小鼠HSC中是否存在虫源Sja-miRNA,我们给BALB/c小鼠感染日本血吸虫尾蚴,在感染后49天时处死小鼠,分离原代HSC并对其miRNA进行高通量测序。通过与日本血吸虫和小鼠miRNA数据库进行比对,筛选出序列与日本血吸虫miRNA完全匹配而与小鼠miRNA不完全匹配的miRNA,即虫源sja-miRNA。结果显示,共鉴定到27条血吸虫来源的miRNA包括sja-bantam,sja-let-7,sja-miR-1,sja-miR-10-5p,sja-miR-125,sja-miR-125b,sja-miR-190-3p,sja-miR-190-5p,sja-miR-2162-3p,sja-miR-2162-5p,sja-miR-2a-3p,sja-miR-2b,sja-miR-2e-3p,sja-miR-2f,sja-miR-3019,sja-miR-3045,sja-miR-3050,sja-miR-3103,sja-miR-3140,sja-miR-3144,sja-miR-3479-3p,sja-miR-3492,sja-miR-3496,sja-miR-36-3p,sja-miR-7-5p,sja-miR-71a,sja-miR-71b。为了验证测序结果,我们采用qPCR验证其中丰度较高的9条虫源sja-miRNA,结果显示在感染小鼠HSC中均检测到这些虫源sja-miRNA。2、Sja-miR-1在血吸虫病肝纤维化中的作用及机制(1)体外激活HSC:我们将Sja-miR-1前体序列连接到腺相关病毒载体pAV-MIR上,构建了Sja-miR-1过表达质粒,命名为pAV-pri-miR-1。为研究Sja-miR-1是否能激活HSC,我们将pAV-pri-miR-1质粒分别转染HSC-T6细胞系和人LX-2细胞系,同时用转染空载体作为对照,48h后用qPCR方法检测转染细胞中Col1a1、Col3a1和a-Sma的表达变化。结果显示,转染Sja-miR-1表达质粒后,Col1a1、Col3a1和a-Sma表达显著增加(p<0.05),表明Sja-miR-1在体外细胞模型中可激活HSC。(2)小鼠体内促肝纤维化的作用:为了能在肝脏中稳定表达Sja-miR-1,我们利用8型重组腺相关病毒(rAAV8)亲嗜肝脏的特点,对pAV-pri-miR-1质粒和空载体进行包装纯化,制备高滴度重组体,分别命名为rAAV8-pri-miR-1和rAAV8-SCR。为观察肝脏过表达Sja-miR-1后对纤维化的影响,我们对BALB/c小鼠尾静脉注射rAAV8-pri-miR-1或等量rAAV8-SCR或等量PBS,50天后处死小鼠分离肝组织和原代HSC用qPCR方法检测Sja-miR-1、Col1a1、Col3a1和a-Sma的表达变化,同时检测肝组织中的羟脯胺酸的含量。结果显示,与rAAV8-SCR和PBS对照组相比,rAAV8-pri-miR-1组小鼠肝组织和HSC中检测到了成熟Sja-miR-1,且Col1a1、Col3a1、a-Sma水平显著升高(p<0.05),羟脯胺酸的含量也显著升高(p<0.05)。这些结果表明,过表达小鼠肝脏中的Sja-miR-1可引起小鼠肝纤维化。(3)虫源Sja-miR-1在血吸虫病肝纤维化中的作用分析:为研究虫源Sja-miR-1在血吸虫病肝纤维化中是否发挥实际作用,我们利用miRNA sponge原理构建了能特异性吸附Sja-miR-1的sponge质粒,即anti-miR-1质粒,并用rAAV8进行包装纯化。我们给感染日本血吸虫BALB/c小鼠尾静脉注射rAAV8-anti-miR-1以吸附进入肝脏细胞的Sja-miR-1,在感染56天后处死小鼠,检测肝脏和原代HSC中纤维化相关基因表达,结果显示,rAAV8-anti-miR-1组Col1a1、Col3a1和a-Sma表达水平较rAAV8-anti-SCR对照组和PBS对照组均显著下降(p<0.05)。羟脯氨酸含量可以反映组织中胶原蛋白的水平,rAAV8-anti-miR-1组与对照组相比,其羟脯氨酸含量显著减少(p<0.05)。我们通过Masson染色和HE染色对肝组织胶原蛋白的面积和虫卵肉芽肿的大小进行了统计分析,结果显示,吸附Sja-miR-1后两者显著减少(p<0.05)。另外,我们对HSC激活的标志物a-SMA进行免疫组化检测,发现rAAV8-anti-miR-1组肝脏中激活的HSC阳性率显著降降低p<0.05。这些结果表明,吸附掉HSC中的虫源Sja-miR-1可以显著减轻血吸虫感染过程中HSC的激活和纤维化严重程度,提示虫源Sja-miR-1在血吸虫感染过程中发挥促肝纤维化的致病作用。(4)虫卵外泌体在体外激活HSC:为研究Sja-miR-1进入HSC的可能机制,我们用PKH67标记虫卵外泌体,将其加入到体外培养的HSC中,研究外泌体在传递虫源sja-miRNA和激活HSC方面的作用。我们发现虫卵外泌体在体外可以进入HSC,并将Sja-miR-1传入HSC。更为重要的是,虫卵外泌体可以促进HSC中纤维化相关基因的表达,而这种促进作用可以被Sja-miR-1 inhibitor拮抗,表明Sja-miR-1参与了外泌体对HSC的激活。(5)虫源Sja-miR-1的靶基因:我们通过miRDB数据库和通路分析预测了Sja-miR-1在小鼠中的靶基因是分泌型卷曲相关蛋白1(Secreted Frizzled-related Protein 1,Sfrp1),并通过相关实验对靶向关系进行了验证。首先我们利用双荧光素酶报告基因系统证实Sja-miR-1可靶向Sfrp1的3’UTR。然后,我们检测了血吸虫感染过程中小鼠HSC中Sja-miR-1和Sfrp1的变化关系,结果显示:感染小鼠HSC中Sja-miR-1表达水平显著升高,而Sfrp1表达水平显著下降,两者呈明显负向调控关系。另外,体外培养的原代HSC转染Sja-miR-1 mimics后,Sfrp1无论是基因水平还是蛋白水平均明显下降。当吸附了感染小鼠HSC的Sja-miR-1后,其Sfrp1基因表达下降可以被部分逆转,相较于对照组明显升高。这些结果表明,Sja-miR-1是通过靶向Sfrp1发挥作用的。(6)Sja-miR-1激活HSC的信号通路:研究已发现Wnt/b-catenin通路与肝纤维化密切相关。SFRP1为该通路的抑制剂,抑制SFRP1的表达可以激活该通路。为研究Sja-miR-1激活HSC是否与该通路有关,我们首先在原代HSC转染Sfrp1siRNA。结果显示,与Sja-miR-1作用类似,干扰SFRP1表达后也能激活HSC。Western blot结果显示,HSC转染Sja-miR-1 mimics或Sfrp1 siRNA后,均可以激活Wnt/b-catenin通路,这说明Sja-miR-1可能通过抑制Sfrp1而激活Wnt/b-catenin通路。我们又在血吸虫感染小鼠模型上进行了验证,相较于未感染组,我们发现血吸虫感染小鼠HSC中Wnt/b-catenin通路明显激活;而抑制HSC中的Sja-miR-1后,Wnt/b-catenin通路也被部分抑制。综上所述,本课题在前期实验结果的基础上,系统鉴定了存在于感染小鼠HSC内的虫源sja-miRNA,并对Sja-miR-1进行了功能和机制研究。一方面,血吸虫感染过程中,Sja-miR-1可以进入到宿主HSC中,这个过程可能需要外泌体的参与。另一方面,我们通过体内和体外相关实验证实,进入到宿主HSC内的Sja-miR-1通过靶向Sfrp1和激活Wnt/b-catenin通路参与了血吸虫病肝纤维化的发生发展。血吸虫病仍是一种危害人类健康的重大寄生虫病,本课题结果表明,虫源Sja-miR-1在血吸虫感染过程中能进入宿主HSC,并以跨物种方式通过靶向Sfrp1基因促进小鼠肝纤维化的发生发展。同时,本课题证实了虫源Sja-miR-1在血吸虫病肝纤维化中发挥作用,从而拓展了我们对血吸虫致病机制的认识,并为血吸虫病肝纤维化的干预治疗提供新的靶点和途径。