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奶牛乳房炎一种严重危害奶牛业的多发性疾病,由多种病原微生物引起,其中主要为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。一直以来,人们主要利用抗生素治疗和控制奶牛乳房炎,但是抗生素的滥用使得耐抗生素菌株不断出现,抗生素疗法效果越来越差。由于引起奶牛乳房炎致病菌种类很多,使得目前利用疫苗预防奶牛乳房炎的效果也不是很理想。因此构建一种新型的可以预防多种细菌感染的疫苗便成为预防奶牛乳房炎的新方向。以往研究表明,金黄色葡萄球菌RNAⅢ激活蛋白靶蛋白(TRAP)能较好的预防实验小鼠感染金黄色葡萄球菌,本实验将traP基因敲入E.coli染色体,借助E.coli外膜蛋白(Omp)A将TRAP蛋白展示于E.coli表面,以获得一种能够同时预防S.aureus和E.coli感染的活菌疫苗。为此,通过Red重组技术将traP基因替换ompA基因478bp-967bp,使TRAP蛋白和OmpA蛋白1~159 aa以融合蛋白的形式表达,并最终展示于E.coli表面。根据已发表的traP基因、ompA基因和质粒pKD3中cm基因序列设计引物,通过重叠延伸PCR分别构建traP-cm基因和cm基因的打靶片段。通过电击转化将打靶片段导入含有质粒pKD46的E.coli DH5α中,利用pKD46表达的Red重组酶以及打靶片段两端的同源臂完成重组,通过PCR扩增、基因测序、Western-blotting和全菌ELISA检测等方法进行鉴定,插入traP-cm片段的阳性重组子命名为TC41,插入cm基因阳性的重组子命名为CM33。将构建好的重组菌免疫接种小鼠,分为TC41-弗式佐剂免疫组、TRAP-弗式佐剂免疫组、PBS-弗式佐剂免疫组、CM33-弗式佐剂免疫组,每组10只小鼠,细菌免疫剂量为5×108 CFU/只,TRAP蛋白免疫剂量为100μg/只,初次免疫21 days后加强免疫,初次免疫后35 days用金黄色葡萄球菌Wood46株、HLJ23-1株、Newman株进行攻毒;用间接ELISA检测各组小鼠血清中的抗体效价、抗体亚类、抗体调理吞噬能力以及血清中细胞因子浓度。结果,用金黄色葡萄球菌Wood46株、HLJ23-1株、Newman株攻击后TC41免疫组小鼠的免疫保护率依次为20%、20%、30%,低于TRAP蛋白免疫组,高于CM33免疫组;TC41产生的抗体为IgG1和IgG2b,抗体效价达到1:4,000以上,低于TRAP蛋白免疫组,高于CM33免疫组;抗体调理吞噬能力显著高于对照组;加强免疫后7 days血清中的IL-4和IFN-γ均高于PBS-佐剂免疫组。以上结果表明,本实验构建的活菌苗TC41能将金黄色葡萄球菌TRAP展示在表面,且能给实验小鼠提供一定的预防金黄色葡萄球菌感染能力。为进一步研究细菌基因功能和开发新型细菌疫苗提供参考。