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第一部分c-Myb在内耳的表达及对氨基糖苷类耳毒性的作用研究研究目的听觉障碍严重影响人们的生活,给家庭和社会带来沉重负担。据世界卫生组织估计,全世界约有3.6亿人群罹患听觉障碍。毛细胞在听力的产生过程中扮演重要角色,它可将声音由机械振动转换为神经冲动,进而产生听力。毛细胞的退化或损伤是听觉障碍产生的重要原因,而噪音、药物、年龄等多种因素均可造成毛细胞损伤。氨基糖苷类药物广泛应用于临床治疗革兰式阴性细菌感染,但其耳毒性如耳鸣、听力损失和前庭功能障碍等严格限制了其临床应用。新霉素为氨基糖苷类药物的一员,具有杀菌作用,其抗菌谱较为广泛,包括化脓性球菌全部菌株、多种革兰式阳性细菌和革兰式阴性细菌。新霉素的耳毒性主要表现为耳蜗毒性,前庭毒性少见,可导致严重的双侧感音神经性聋。目前认为新霉素可诱导毛细胞产生过多的活性氧簇,干扰细胞内氧化还原平衡,进而激活内源性凋亡通路,致使毛细胞死亡。c-Myb是Myb家族的一员,属高度保守的转录因子,在细胞的增殖、分化及凋亡中扮演重要角色。在多种组织细胞中,Bcl-2被认为是c-Myb的靶基因,c-Myb可通过调节Bcl-2的表达进而调控凋亡通路;而且c-Myb过表达会使细胞内产生较少的活性氧簇,进而减少氧化应激。目前已有文献报道c-Myb表达于鸡胚内耳听板中,与Soxl0协同调控鸡胚内耳听板发育,但其在哺乳动物内耳中的表达和功能尚未可知。我们的研究目的在于:(1)明确c-Myb在小鼠基底膜及HEI-OC1细胞中的表达情况;(2)探讨c-Myb与新霉素耳毒性的相关性;(3)探讨在HEI-OC1细胞中下调c-Myb是否会改变其对新霉素的敏感性及潜在机制。研究方法1.取出生后1天、7天、11天、14天及30天的C57BL/6小鼠,运用免疫荧光染色从铺片和冰冻切片两个角度定位c-Myb在基底膜上的表达,Myosin 7a为毛细胞标记物,Sox2为支持细胞标记物。2.取C57BL/6小鼠新鲜耳蜗基底膜组织,提取mRNA和蛋白质,qRT-PCR和western blot法检测c-Myb在生后1天、7天、1 1天、14天和30天的表达变化。3.免疫荧光、PCR及western blot法确定c-Myb在HEI-OC1细胞中的表达情况,Myosin 7a为毛细胞标记物。4.为建立小鼠耳聋动物模型,将C57BL/6小鼠随机分为两组,于生后8-14天分别注射新霉素(200 mg/kg)及等量生理盐水,生后17天运用免疫荧光和western blot法检测新霉素组与对照组c-Myb表达水平的变化。5.HEI-OC1细胞给予2 mM新霉素处理,于0 h、4 h、8 h、12 h和24 h检测c-Myb表达水平的变化。6.运用shRNA转染法下调HEI-OC1细胞中c-Myb表达,免疫荧光、qRT-PCR和western blot法检测shRNA的转染效率。7.HEI-OC1细胞成功转染后,给予0 mM、1 mM、1.5 mM和2 mM新霉素分别处理24 h或48 h,MTT法检测处理后HEI-OC1细胞存活率。8.HEI-OC1细胞转染后48h,2 mM新霉素处理24h后,应用流式分析、TUNEL染色检测HEI-OC1细胞凋亡改变。9.HEI-OC1细胞转染后48 h,2 mM新霉素处理24 h后,qRT-PCR法检测Apaf-1、Bax、caspase-3和caspase-9的mRNA表达,western blot 检测cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bcl-2的蛋白表达水平。10.HEI-OC1细胞转染后48h,2 mM新霉素处理24 h后,MitoSOX染色和流式分析法检测细胞内活性氧簇变化。11.HEI-OC1细胞转染后48 h,western blot法检测HEI-OC1细胞中Bcl-2蛋白水平。研究结果1.基底膜铺片和耳蜗切片的免疫荧光结果提示c-Myb存在于哺乳动物内耳中,且特异性地表达于内耳毛细胞。2.qRT-PCR和western blot结果表明c-Myb在内耳的表达具有时间依赖性,生后14天为其表达高峰点。3.免疫荧光、PCR和western blot结果显示,c-Myb表达于HEI-OC1细胞系中。4.免疫荧光和western blot结果显示,C57BL/6小鼠给予新霉素处理后,其内耳毛细胞中c-Myb表达较对照组显著降低(**p<0.01)。5.HEI-OC1细胞给予新霉素处理后,免疫荧光、qRT-PCR和estern blot结果显示新霉素处理组c-Myb表达显著降低,且具有时间依赖性。6.HEI-OC1细胞给予shRNA转染,免疫荧光、qRT-PCR和western blot结果显示shRNA-Myb组c-Myb表达水平明显低于shRNA-Control组(***p<0.001)。7.转染后HEI-OC1细胞给予新霉素损伤,随着新霉素浓度的提高,HEI-OC1细胞存活率降低,且新霉素处理48 h组其细胞存活率明显低于24 h组;不同浓度和时间条件下shRNA-Myb组细胞存活率均低于shRNA-Control组(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。8.流式分析及TUNEL染色显示,新霉素处理后shRNA-Myb组HEI-OC1细胞凋亡率较shRNA-Control组显著提高(**p<0.01,***p<0.001)。9.qRT-PCR和western blot结果表明,新霉素处理后shRNA-Myb组Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Apaf-1 表达增高,Bcl-2表达降低。10.HEI-OC1细胞转染下调c-Myb表达,不给予新霉素损伤时,Bcl-2表达明显降低。11.MitoSOX染色显示,新霉素处理后shRNA-Myb组细胞内活性氧簇水平较shRNA-Control组明显升高。研究结论本研究首次发现c-Myb存在于哺乳动物内耳,特异性地表达于内耳毛细胞及HEI-OC1细胞中,且其表达具有时间依赖性。新霉素损伤后内耳毛细胞和HEI-OC1细胞中c-Myb表达降低,提示c-Myb与新霉素耳毒性密切相关,在正常内耳毛细胞和HEI-OC1细胞中可能起保护作用。在HEI-OC1细胞中下调c-Myb表达会使抗凋亡因子Bcl-2水平降低,在给予新霉素损伤后,细胞内活性氧水平明显升高,促凋亡因子Bax、Apaf-1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达增高,抗凋亡因子Bcl-2表达进一步降低,HEI-OC1细胞凋亡增加,存活率降低。总而言之,c-Myb低表达会增加HEI-OC1细胞对新霉素的敏感性,c-Myb可能为预防氨基糖苷类耳毒性的新靶点。第二部分Paeoniflorin对氨基糖苷类耳毒性的作用及机制研究研究目的芍药苷(Paeoniflorin,PF)为一种单萜苷复合物,由芍药提取而来,具有镇痛、抗炎、抗抑郁等多种生物活性。近期研究表明,PF同时具有抗氧化活性和抗凋亡活性。氨基糖苷类药物广泛应用于临床治疗革兰氏阴性细菌感染,但听力损失、耳鸣及前庭功能障碍等耳毒性严格限制其临床应用。新霉素为氨基糖苷类药物一员,抗菌谱广泛,能够杀死多种革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌及化脓性球菌。其耳毒性主要表现为耳蜗毒性,前庭毒性少见,可导致严重的双侧感音神经性聋。据文献报道新霉素耳毒性最常见的原因是毛细胞损害,新霉素可诱导毛细胞内活性氧产生过量,影响细胞内氧化还原平衡,进而激活内源性凋亡通路,致使毛细胞死亡,而MAPK蛋白家族为此过程的重要参与因子。目前大量研究证实PF在细胞中发挥抗氧化和抗凋亡作用,但其在新霉素耳毒性中的作用尚未可知。本研究旨在研究PF在新霉素耳毒性中的作用及潜在机制。研究方法1.体内实验中,取出生后8天C57BL/6小鼠,新霉素组连续7天皮下注射200 mg/kg新霉素,PF组仅给予30 mg/kg PF腹腔注射,PF+新霉素组先给予30 mg/kg PF腹腔注射,再给予200 mg/kg新霉素连续注射7天,对照组仅给予等量生理盐水,出生后30天解剖出耳蜗。2.运用免疫荧光染色法鉴定体内实验中各组小鼠毛细胞形态、排列及存活数变化。3.运用TUNEL/Myosin 7a染色法鉴定体内实验中各组小鼠毛细胞凋亡改变。4.体外实验取生后3天C57BL/6小鼠的基底膜进行培养,新霉素组给予2 mM新霉素处理24 h,PF组给予30 μM PF处理,PF+新霉素组给予30 μM PF预处理2 h,后新霉素处理24 h,对照组不与处理。5.免疫荧光染色法鉴定体外试验各组毛细胞形态、排列及存活数变化。6.TUNEL/Myosin 7a染色法鉴定体外实验各组小鼠毛细胞凋亡改变。7.Western blot法鉴定体内及体外实验各组凋亡因子的变化。8.免疫荧光染色及western blot法鉴定小鼠基底膜内p-ERK表达变化。9.MitoSOX染色法鉴定小鼠毛细胞内活性氧的变化。研究结果1.免疫荧光染色结果示,对照组与PF组毛细胞排列整齐、无缺失;新霉素组毛细胞排列紊乱、严重缺失;PF+新霉素组毛细胞形态尚可、缺失较少。2.剩余毛细胞计数显示,PF组与对照组毛细胞无明显缺失,新霉素组毛细胞较对照组明显减少(#p<0.05),PF+新霉素组毛细胞剩余数高于新霉素组(*p<0.05)。3.TUNEL染色显示,新霉素组毛细胞凋亡较对照组明显增高,PF+新霉素组毛细胞凋亡较新霉素组明显降低(*p<0.05)。4.Western blot结果显示,新霉素组cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平明显高于对照组,而Bcl-2表达低于对照组(#p<0.05);PF+新霉素组cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达低于新霉素组,而Bcl-2表达高于新霉素组(*p<0.05)。5.免疫荧光和western blot结果显示,新霉素组p-ERK表达高于对照组(##p<0.01),PF+新霉素组p-ERK表达低于新霉素组(*p<0.05)。6.MitoSOX染色显示新霉素组活性氧水平高于对照组,PF+新霉素组活性氧水平低于新霉素组。研究结论新霉素诱导的毛细胞损伤与活性氧过量、ERK通路活化和线粒体凋亡激活密切相关。PF可通过减少活性氧产生、降低ERK通路活化和抑制线粒体凋亡途径保护毛细胞免受新霉素损伤。我们的研究提示PF可能为预防氨基糖苷类耳毒性的新型药物。