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目的蛋白质组学技术筛选肝癌病人组织体外培养分泌蛋白,寻找肝癌诊断潜在的候选标志物,通过GO和IPA分析,初步探讨其在肝癌发生发展的分子机制,并结合病人临床资料,验证差异蛋白在肝癌诊断、复发预测及预后评估中的作用。方法1.无血清培养肝癌组织、癌旁组织以及远癌组织,对不同培养时间的组织进行苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)、TUNEL(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling)细胞凋亡及免疫蛋白印迹(Western Blot,WB)检测优化获得分泌蛋白的最佳时间。2.iTRAQ联合2D LC-MS/MS)技术分析肝癌组织体外无血清培养分泌蛋白,筛选差异表达分泌蛋白,初步了解肝癌组织分泌蛋白质组学的特征。3.对筛选到的差异表达分泌蛋白进行GO(Gene Ontology)和IPA(Ingenuity Pathway Analysis)分析。GO分析包括亚细胞定位(Cell component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)及生物过程(Biological Process,BP)分类,IPA分析差异表达蛋白的生物通路和蛋白质相互作用网络。4.收集49例HCC病人术前血清及23例配对健康人血清,平行反应监视(Parallel reaction monitoring,PRM)分析差异分泌蛋白CA2、KRT19在HCC病人和健康人中的血清浓度。受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC)比较CA 2、KRT 19单独及联合诊断肝癌的能力。另收集82例肝癌病人术后血清标本,ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay,)检测差异表达蛋白CA 2在肝癌病人中的血清浓度,Logistic回归分析HCC病人血清CA 2浓度与临床病理特征的关系和术后复发转移的关系,生存曲线分析HCC病人血清CA2浓度与肝癌复发以及生存率之间的关系。结果1.对肝癌组织进行体外无血清培养并提取分泌蛋白,对不同培养时间的组织进行HE染色,细胞凋亡检测,结果发现肝癌组织培养24小时是提取分泌蛋白的最好时间点。Western Blot检测发现提取的分泌蛋白无胞内蛋白污染。2.iTRAQ联合2D LC-MS/MS技术分析肝癌组织体外无血清培养的分泌蛋白质组学差异,共鉴定出2388种分泌蛋白,这些蛋白符合分泌蛋白的蛋白组学特征。癌组织与远癌组织比较发现36个差异分泌蛋白,其中表达上调14个,表达下调22个;癌旁组织与远癌组织比较发现90个差异分泌蛋白,其中表达上调27个,表达下调63个;两组有24个共同的差异表达蛋白,其中有11个表达上调,13个表达下调。3.对差异分泌蛋白进行GO和IPA分析。癌组织与远癌组织(C/F组)的差异分泌蛋白主要涉及代谢进程、与生长发育相关的进程、肿瘤微环境改变等;癌旁组织与远癌组织(P/F组)的差异分泌蛋白主要涉及代谢进程,特别是含硫化合物的代谢,以及酶抑制等。IPA分析发现C/F组的差异分泌蛋白主要以胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)为中心的调控网络,P/F组的差异分泌蛋白主要以磷脂酰肌醇-3-羟激酶/丝氨酸激酶(Phosphatidylinosit ol 3 kinase/Serine/threonine kinase,PI3K/AKT)为中心的调控网络,两组共同的差异表达蛋白主要以核转录因子κB(Transcription factor nuclear factor-κB,NF-κB)为中心的调控网络。4.PRM分析差异分泌蛋白碳酸酐酶2(Carbonic anhydrase 2,CA2)、细胞角蛋白19(Keratin,type I cytoskeletal 19,KRT19)在HCC病人和健康人中的血清浓度,结果表明CA2和KRT19肝癌病人的血清中的表达量显著高于其在正常人血清中的含量。ROC分析CA2和KRT19诊断肝癌的曲线下面积分别是0.715和0.728,CA2与KRT19联合诊断肝癌的AUC为0.817(P=0.000),敏感性为67.3%,特异性为87%。ELISA法检测差异表达蛋白CA2在肝癌术后病人中的血清浓度,CA2在肝癌复发病人血清中的浓度显著高于未复发病人(P<0.05)。Logistic回归发现CA2表达与肿瘤数目(P=0.026)和BCLC分期(P=0.042)显著相关,CA2为影响HCC根治性切除术后复发/转移的独立危险因素(P<0.05)。生存曲线分析发现CA2低浓度的肝癌病人的无复发生存率显著高于CA2高浓度的肝癌病人(P<0.05)。结论1.体外培养肝癌组织并提取分泌蛋白的方法可靠。2.iTRAQ联合2D LC-MS/MS技术可以筛选出一系列原发性肝癌组织相关差异分泌蛋白,这些差异蛋白有望成为肝癌诊断潜在的候选标志物。3.含硫氨基酸代谢紊乱与肝癌的早期发生关系密切,乙醇代谢紊乱在肝癌发生、发展中起着重要作用。CA2、KRT19可能通过ERK、AKT/PI3K、NF-k B蛋白-蛋白相互作用网络通路促进肝癌的发生发展。4.CA2和KRT19有望成为肝癌诊断的候选标志物;CA2还可用于肝癌病人术后复发转移的预测及无复发生存率的评估。