论文部分内容阅读
目的:探讨血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)/血管紧张素Ⅱ1型受体(AngiotensionⅡReceptor 1,AT1R)通路激活人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)PP2A(Protein Phosphatase 2A,PP2A)导致eNOS Ser1177磷酸化水平下调的分子机制。方法:首先明确AngⅡ下调HUVECs中eNOS Ser1177的浓度及时间依赖效应,将HUVECs随机分为正常对照(Control)组和AngⅡ处理组(AngⅡ浓度分别为1.0×10-9mol/L、1.0×10-8mol/L、1.0×10-7mol/L、1.0×10-6mol/L和1.0×10-5mol/L),AngⅡ处理时间分别为12h、24h和36h。然后根据AngⅡ下调eNOS Ser1177的浓度和时间效应,进一步探讨eNOS Ser1177下调的分子机制,将HUVECs随机分为4组,分别为正常对照(Control)组、AngⅡ处理组(AngⅡ终浓度为1.0×10-7mol/L和1.0×10-6mol/L,处理12h)、单纯CAN组[采用AT1R阻断剂坎地沙坦(candesartan,CAN)终浓度为1.0×10-6mol/L,预处理3h]和CAN+AngⅡ组(CAN的使用浓度和时间同单纯CAN组,AngⅡ的使用浓度和时间同AngⅡ处理组)。用Western blot方法检测各组eNOS蛋白表达、eNOS Ser1177位点磷酸化水平、PP2A-Cα蛋白表达、PP2Ac-Tyr307位点磷酸化水平和PP2A内源性抑制蛋白I2PP2A的表达水平。采用化学比色法检测各组细胞培养基中NO含量。结果:(1)与Control组比较,给予1.0×10-9mol/L、1.0×10-8mol/L、1.0×10-7mol/L、1.0×10-6mol/L、1.0×10-5mol/L的AngⅡ分别处理HUVECs 12h、24h、36h后,eNOS Ser1177磷酸化水平均下调(p<0.05),AngⅡ各组间eNOS Ser1177磷酸化水平差异无统计学意义,而各组间eNOS蛋白表达水平差异无统计学意义。(2)与同一浓度AngⅡ处理12h组比较,CAN预处理组可上调eNOS Ser1177磷酸化水平,而eNOS蛋白表达水平差异无统计学意义。(3)与Control组比较,AngⅡ处理12h后PP2Ac-Tyr307磷酸化水平下调(p<0.05);与同一浓度AngⅡ处理12h组比较,CAN预处理组可上调PP2Ac-Tyr307磷酸化水平(p<0.05),而各组间PP2A-Cα蛋白表达差异无统计学意义。(4)与Control组比较,AngⅡ处理12h后PP2A内源性抑制蛋白I2PP2A的表达减少(p<0.05);与同一浓度AngⅡ处理12h组比较,CAN预处理组可增加PP2A内源性抑制蛋白I2PP2A的表达(p<0.05)。(5)与Control组比较,AngⅡ处理12h后细胞培养基中NO含量减少(p<0.05);与同一浓度AngⅡ处理12h组比较,CAN预处理组可增加细胞培养基中NO含量(p<0.05)。结论:AngⅡ可通过AT1R通路导致人脐静脉内皮细胞eNOS Ser1177磷酸化水平下调,NO产生减少,这一效应可能与通过降低PP2A内源性抑制蛋白I2PP2A的表达和PP2Ac亚基的Tyr307位点磷酸化水平,导致PP2A活性增强相关。而AT1R阻滞剂CAN预处理,可通过增加I2PP2A的表达,上调PP2Ac亚基Tyr307位点磷酸化水平,最终导致eNOS Ser1177磷酸化水平和eNOS活性恢复,从而为临床防治与内皮功能障碍相关的心脑血管疾病提供实验依据。