蒲黄为香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifoliaL.、东方香蒲Typha orientalis Presl.或同属植物的干燥花粉。该药长于收敛止血,兼有活血化瘀之功,有止血不留瘀的特点,用于吐血、咯血、崩漏、尿血等,亦可用于跌打损伤、痛经、产后疼痛、心腹疼痛等瘀血作痛者。蒲黄为临床常用中药,既可内服,也可外用,且该药毒副作用小,有较好的应用前景。蒲黄生品性滑,偏于活血化瘀止痛,炒炭后性涩,偏于止血。中药临床治疗疾病的过程中,药物与药物之间的配伍作用显得尤为重要,因此我们将饮片的不同炮制品纳入复方中互换,对互换后的复方活性进行研究,探索配伍作用的异同。目前蒲黄和蒲黄炭在临床应用中存在混用的现象,处方应付不明确,为了规范蒲黄和蒲黄炭的临床合理用药,本文将蒲黄、蒲黄炭分别纳入到复方失笑散(蒲黄与五灵脂)、二神散(蒲黄炭与香附炭)中,探讨蒲黄、蒲黄炭及其在复方中的化学成分和生物活性的变化,为蒲黄的生熟异用的合理性提供依据。本论文分为三个部分。第一章为文献研究,总结了蒲黄化学成分、药理作用及临床应用的研究进展。第二章为蒲黄、蒲黄炭、失笑散、二神散化学研究,包括蒲黄生品、炭品的薄层鉴别,失笑散的液质联用分析,二神散的GC-MS分析及HPLC-MS联用分析,失笑散的HPLC指纹图谱研究,蒲黄、蒲黄炭在复方中成分溶出率的的异同研究。第三章为蒲黄及其复方活血效应评价,包括蒲黄中成分对LPS损伤的HUVEC保护作用,蒲黄、蒲黄炭与五灵脂配伍活血效应评价。实验研究内容如下:1文献研究通过查阅相关古今文献及国内外学者的研究成果,对本课题的研究对象蒲黄及蒲黄炭的化学成分、药理作用和临床应用等方面资料进行总结,为蒲黄在复方中生熟异用的物质基础研究提供依据。2蒲黄、蒲黄炭、失笑散、二神散化学研究。2.1蒲黄生品、炭品的薄层鉴别。薄层色谱法具有分离分析双重功效,大大提高了分离鉴定的灵敏度和专属性,本文针对蒲黄和蒲黄炭中的黄酮苷和苷元结构、极性差异较大的特点采用两种色谱条件进行定性鉴别,结果显示,蒲黄炒炭后,异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、香蒲新苷明显减少,异鼠李素增加,二者苷类成分苷元均为异鼠李素,推测蒲黄炒炭时加热使黄酮苷分解为黄酮苷元,揭示蒲黄和蒲黄炭生熟异用物质基础的实质异同。2.2失笑散的液质联用分析。采用LC-20A型快速液相色谱仪对失笑散进行分析,对主要离子碎片裂解过程进行解析,鉴定出35个化合物主要为黄酮类成分和二萜类成分,为阐明蒲黄在复方失笑散中作用的效应物质基础提供依据。2.3二神散的GC-MS分析及HPLC-MS联用分析。采用GC-MS和LC-20A型快速液相色谱仪对二神散进行分析,对主要离子碎片裂解过程进行解析。结果显示,二神散气质联用分析鉴定出62个化合物,其中18个含量高于1%,液质联用中鉴定出15个化合物,气质联用主要为香附炭中挥发油性成分及少量蒲黄炭中烷烃类成分,液质联用主要为蒲黄炭中黄酮类成分,为阐明蒲黄炭在复方二神散中作用的效应物质基础提供依据。2.4失笑散的HPLC指纹图谱研究。本节选用10批不同来源的蒲黄和五灵脂,采用HPLC法,鉴定5个主要特征峰,包括香蒲新苷,异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷,异鼠李素,槲皮素,穗花杉双黄酮。通过失笑散与各单味药进行定位对照及UV光谱分析,结果绝大多数特征峰归属明确,极性大的成分主要为蒲黄中成分,极性小的成分主要源于五灵脂。该方法可操作性强、重复性好,可作为复方失笑散指纹图谱研究。本实验分析了 10批次失笑散的HPLC指纹图谱,结果表明10批次均具有15个特征峰,峰面积相对量有一定的差异性,相似度均大于0.965,所建立的方法可以较好评价失笑散的质量。"2.5蒲黄、蒲黄炭在复方中成分溶出率的的异用研究。2.5.1失笑散中蒲黄替换为蒲黄炭对复方中成分溶出率的影响。本节选用失笑散复方及失笑散对照复方(失笑散中蒲黄替换为蒲黄炭),比较二者浸膏量及代表性化学成分香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、穗花杉双黄酮的溶出率。结果表明,蒲黄与五灵脂合煎,所得浸膏率为14.0%,蒲黄与五灵脂单独煎煮后合并,所得浸膏率为13.8%,浸膏量提高0.2%;失笑散中香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、穗花杉双黄酮含量分别为4.32、3.94、0.0110 mg.g-1,较单独煎煮合并后比较,分别提高8%,2%,9%,推测蒲黄与五灵脂配伍有促进溶出的作用。与失笑散对照合煎剂比较,失笑散合煎剂所得浸膏量增加3.3%。五灵脂与蒲黄配伍较五灵脂与蒲黄炭配伍,穗花杉双黄酮含量提高7%,推测蒲黄较蒲黄炭能促进五灵脂中穗花杉双黄酮的溶出。2.5.2二神散中蒲黄炭替换为蒲黄对复方中成分溶出率的影响。本节选用二神散复方及二神散对照复方(二神散中蒲黄炭替换为蒲黄),比较二者浸膏量及代表性化学成分香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、α-香附酮的溶出率。结果表明,蒲黄炭与香附炭合煎,所得浸膏率为9.6%,蒲黄炭与香附炭单独煎煮后合并,所得浸膏率为9.6%,浸膏量基本无显著变化;二神散中香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、α-香附酮含量分别为0.62、0.61、0.39mg.g-1,较单独煎煮合并后比较,分别提高12%、10%、6%,推测蒲黄炭与香附炭配伍可以相互促进溶出。与二神散对照合煎剂比较,二神散合煎剂溶出率降低3.2%,应该与蒲黄炒炭后黄酮苷类成分减少有关;蒲黄炭与香附炭配伍较蒲黄与香附炭配伍,α-香附酮含量提高12%,推测蒲黄炭较蒲黄能促进香附炭中α-香附酮的溶出。3蒲黄及其复方活血效应评价。3.1蒲黄中成分对HUVEC损伤的保护作用。3.1.1蒲黄中成分对HUVEC的增殖抑制作用。本节通过体外培养HUVEC,利用MTT比色法测定细胞相对抑制率,结果表明,在相应剂量范围内,蒲黄中香蒲新苷、异鼠李素-3-0-新橙皮糖苷、槲皮素、柚皮素、烟酸不仅对HUVEC的增殖无抑制作用,相反有一定促进细胞增殖作用,而表现出一定的活性。其他成分胸腺嘧啶、尿嘧啶、十八烷酸丙酸醇酯及香草酸在相应的剂量范围内未表现出对HUVEC增殖的抑制作用,从而确定各成分安全剂量范围,为各成分的活性研究剂量浓度提供依据。3.1.2蒲黄中成分对LPS损伤HUVEC的保护作用。本节采用LPS诱导制备HUVEC损伤模型,采用MTT比色法测定细胞活力、黄嘌呤氧化酶法测定细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)活力、TBA法测定丙二醛(MDA)含量、硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)含量,结果显示,LPS诱导的HUVEC细胞上清液中NO、MDA含量显著增加,SOD活力显著降低;蒲黄中的香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素、柚皮素、烟酸可显著提高细胞活力,细胞上清液中NO、MDA含量降低,SOD活力提高,通过抑制NO释放、抑制脂质过氧化以及抗氧化保护损伤的血管人脐静脉内皮细胞。中医认为,异常出血及外伤可致使血瘀产生,蒲黄中的有效成分可以保护损伤的内皮细胞,使之正常协调凝血与抗凝血间的平衡,维持血管舒张因子和收缩因子的平衡,从而维持血管的张力和血流的稳定,起到止血活血作用,此研究在细胞水平上阐释蒲黄活血的作用机制。3.2蒲黄、蒲黄炭与五灵脂配伍活血效应评价。3.2.1蒲黄、蒲黄炭与五灵脂配伍对血瘀模型大鼠血液流变学及凝血功能的影响。蒲黄生品、炭品复方均能明显降低血瘀模型大鼠全血粘度及血浆粘度,表现出改善血液循环作用,且生品复方优于炭品。二者均可延长各阶段凝血时间,降低纤维蛋白含量,表现出一定的活血作用,且生品复方优于炭品复方。3.2.2蒲黄、蒲黄炭与五灵脂配伍对血瘀模型大鼠血小板的影响。蒲黄生品、炭品复方均可抑制由ADP诱导的血小板聚集,对TXB2及6-keto-PGF1α均具有一定的回调作用,表现出一定的活血作用,且生品复方优于炭品复方。3.2.3蒲黄、蒲黄炭与五灵脂配伍对血瘀模型大鼠舌、肺、子宫的影响。蒲黄生品、炭品复方均可对血瘀模型大鼠舌、肺、子宫损伤起到一定的治疗和恢复作用,且生品复方强于炭品复方。蒲黄生品、炭品与五灵脂配伍均有一定的活血化瘀作用,其活血化瘀活性表现为降低血液粘度、延长凝血时间、抑制血小板聚集等,且生品强于炭品,这正体现了生品行血,炒炭涩性增加,活血作用减弱这一传统的炮制理论,为蒲黄在临床上的生熟异用提供了科学依据。