UPLc-MS快速测定血清1,5-脱水葡萄糖醇方法的建立及应用

来源 :温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yinqing68
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在临床糖尿病(DM)诊断中,评估血糖控制的常规方法,如糖化血红蛋白(HbA1c)或自我血糖监测(SMBG),专注于监控时间段内平均血糖或空腹血糖水平,而忽略了血糖波动情况,对于糖尿病血糖控制与治疗来说这是一种缺陷[1~3]。因此,需要寻找其他的监测血糖的方法来完善对血糖的监测。  1,5-脱水葡萄糖醇(1,5-anhydroglucitol,1,5-AG)是一种重要的人血清多元醇,其结构类似于D-葡萄糖,在体内的平衡可以由口腔摄入和尿排泄来维持。多项研究表明,1,5-AG不能被代谢;正常情况下,它从尿中排泄时,近99.9%由肾脏再吸收,并且其在再吸收时与葡萄糖共用一个转运体。当出现高血糖状况时,1,5-AG的再吸收会受到血糖的竞争性抑制,最终导致血清中其含量迅速降低。经过治疗后血糖恢复正常时,1,5-AG的再吸收得到恢复,血清中1,5-AG快速恢复到正常水平[4,5]。可以利用1,5-AG监测糖尿病,作为HbA1c的补充标志物,同时也可作为近期的血糖控制和餐后高血糖,或血糖波动超出肾糖阈标志。  目的:  本研究采用超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS),对1,5-AG的分析检测展开研究:1、建立一种特异性好、分析时间短、灵敏度高的血清1,5-AG检测分析方法,满足临床检验或科研研究中大量样本快速检测的要求;2、将建好的方法应用于糖尿病(diabetes mellitus,DM)、心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)以及妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)患者血清1,5-AG检测分析中,研究1,5-AG作为血糖监测的标志物进行临床检验诊断的可行性,为糖尿病的预防及治疗提供依据。  方法:  1、UPLC-MS检测1,5-脱水葡萄糖醇方法的建立  本研究运用特异性强、灵敏度高的液相色谱-质谱联用仪,采用ZORBAXSB-C18(150mm×4.6mm,5μm,Agilent)色谱柱,对血清样品的提取方法、流动相各组分比例、缓冲盐的浓度以及质谱检测器各项参数进行优化,建立一种快速、灵敏检测1,5-AG的UPLC-MS方法。  2、UPLC-MS检测1,5-脱水葡萄糖醇方法的验证  在以牛血清白蛋白(BSA)为空白基质中,对建立的方法进行线性回归、最低检测限、最低定量下限(LLOQ)、准确度、日间和日内精密度、提取回收率及稳定性等基本的方法学验证。  3、血清样本中1,5-脱水葡萄糖醇的含量测定  以DM、CVD以及GDM患者研究对象,将收集到的血清经甲醇预处理脱蛋白后,上机检测分析1,5-AG的含量差异。  结果:  1、通过优化液相色谱及质谱的各项条件、参数,成功建立了能快速测定血清1,5-AG的UPLC-MS方法,单个样品运行时间10 min,血清样品预处理方法简单。方法学考察结果表明:此方法具有较好的特异性,在0.1-50μg/mL范围内线性关系良好,最低定量下限为0.1μg/mL,日内和日间精密度均在1.4%-10.0%之间,准确度在96.50%-101.3%之间,能满足临床或科研研究中大量样本快速检测的要求。  2、将上述建立好的UPLC-MS方法应用于DM、CVD以及GDM患者血清中1,5-AG的测定,发现1,5-AG含量在患病者与正常对照组间具有明显的差异,差异具有统计学意义(P<0.05)。  结论:  通过优化液相色谱及质谱的各项条件、参数,成功建立了能同时快速测定血清1,5-AG的UPLC-MS方法,该方法的特异性好、灵敏度高、检测时间短,准确度及重复性均能满足临床或科研研究中大量样本快速检测的要求。该方法应用于DM、CVD以及GDM患者中1,5-AG的测定,发现1,5-AG在患病者与正常对照组间具有明显的差异,且差异有统计学意义(P<0.05),初步验证了1,5-AG作为血糖标志物的可行性。
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