第一部分脊髓背角BDNF/trkB-KCC2信号通路和瑞芬太尼诱发大鼠术后痛觉过敏的关系研究阿片类药物在临床麻醉中应用广泛。在手术过程中,阿片受体激动剂(芬太尼、瑞芬太尼、舒芬太尼等)是最常用的疼痛治疗药物。但是在临床使用阿片类药物的过程中发现,停用此类药物后患者会出现痛觉过敏:麻醉时应用阿片类药物的患者在手术后会出现把正常刺激视为疼痛或者把轻微的疼痛感觉视为剧痛,也就是痛阈值降低,这称为阿片药物诱发的痛觉过敏OIH(opioid-induced hyperalgesia)。在临床表现为术后镇痛药物的使用量增加,并且可以持续较长时间,这降低了患者术后的生活质量且延缓了患者的术后恢复。许多研究已经明确,瑞芬太尼是一种具有明显诱发术后痛觉过敏作用的阿片类药,虽然它有着诸多的临床使用优点,例如代谢迅速无蓄积,镇痛作用强而稳定,且有一定的降低血压和心率的作用,但是它所带来的痛觉过敏负面作用亦不容忽视,这加重了患者不适,影响术后功能活动,延长了住院时间。目前瑞芬太尼痛觉过敏(Remifentanil-introduced hyperalgesia,RIH)的确切的发生机制和相关信号通路仍不十分明确。另外,目前对于瑞芬太尼所致痛觉过敏的研究多限于术后短期内(24至48小时),尚较少有关于其时长的研究。细胞膜上的钾氯共转运体-2(K+-Cl--cotransporter 2,KCC2)是维持神经元内外氯离子浓度稳定性和动态平衡的主要因素。KCC2表达减少或者活性降低会导致细胞内氯离子堆积,GABA能神经元发生去抑制改变,导致了疼痛的发生和发展。脑源性神经营养因子BDNF能够与酪氨酸受体激酶B(tyrosine receptor kinase B,TrkB)结合,进而下调KCC2的蛋白表达,从而减少Cl-的转运,增加细胞内Cl-的积累,减弱GABA能神经元的抑制性作用,机体出现痛觉过敏。但对于脊髓水平BDNF/trkB-KCC2信号通路是否参与瑞芬太尼诱发的大鼠术后痛觉过敏的产生,仍未见有相关报道。本实验中,我们进行30min的皮下泵注瑞芬太尼(80μg/kg),并按Brennan法完成右足底切口,以制备瑞芬太尼痛觉过敏模型。鞘内给予TrkB受体抑制剂TrkB/Fc,对BDNF、TrkB和KCC2表达变化进行检测,从而探讨脊髓背角BDNF/trkB-KCC2信号通路在瑞芬太尼诱发的痛觉过敏中的作用。机械性缩足阈值(Paw Withdrawal Mechanical Threshold,PWMT))和热缩足反射潜伏期(Paw Withdrawal Thermal Latency,PWTL)被用来进行疼痛行为学评估。术前24h(基础值),术后的4h,ld,2d,4d,7d,10d,12d,14d和21d进行行为学的测定。术后1d检测脊髓背角BDNF、TrkB和KCC2的表达。术前 15min鞘内注射TrkB/Fc,并在术后4h,ld,2d,4d,7d,10d,12d,14d和21d检测疼痛行为学变化,术后1d检测脊髓背角KCC2的表达。结果:1、瑞芬太尼痛觉过敏可持续至术后约两周;2、瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角的BDNF、TrkB表达显著上调,KCC2的表达显著下调;3、TrkB/Fc可以抑制瑞芬太尼诱发的大鼠术后痛觉过敏,缩短痛觉过敏的时长,且能上调瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角KCC2的表达。综上所述,本实验以切口痛模型为基础,术中皮下输注瑞芬太尼制备瑞芬太尼诱发术后痛觉过敏模型,观测了瑞芬太尼痛觉过敏的时长,并研究了BDNF/trkB-KCC2信号通路和瑞芬太尼诱发的大鼠术后痛觉过敏的关系。瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角BDNF、TrkB表达上调,KCC2表达下调。TrkB受体抑制剂TrkB/Fc可以通过抑制脊髓背角KCC2下调来缓解瑞芬太尼诱发的大鼠术后痛觉过敏,并且能缩短痛觉过敏的时长。本研究为临床治疗痛觉过敏提供了新的依据。第二部分脊髓α7nAChRs激活对瑞芬太尼诱发大鼠术后痛觉过敏的时长和脊髓背角BDNF/trkB-KCC2信号通路的影响在痛觉过敏的产生和发展过程中,中枢及外周的免疫相关细胞均发挥着重要作用,它们参与了中枢敏化的形成。作为中枢神经系统的免疫相关细胞,脊髓小胶质细胞激活后可以释放促炎性产物以及对下游信号转导通路进行调节,这被认为是痛觉过敏产生和维持的重要因素。因此,对小胶质细胞下游信号通路的抑制可作为疼痛治疗的方向。α7亚型乙酰胆碱受体(α7nAChRs)在中枢神经系统分布丰富,尤其是在小胶质细胞,且小胶质细胞的α7nAChRs激活可以明显减少促炎性产物的释放。激活脊髓α7nAChRs已被证实在多种疼痛模型中均产生明显的抗伤害性效应。本课题组之前的研究提示,瑞芬太尼痛觉过敏大鼠的脊髓背角小胶质细胞明显活化;激活脊髓α7nAChRs可能通过抑制小胶质细胞及其炎性因子的释放而缓解瑞芬太尼诱发的大鼠术后痛觉过敏。研究证明,抑制脊髓小胶质细胞的活化还可以下调脊髓背角BDNF的表达并抑制其与TrkB的结合,快速上调KCC2的表达,从而增加Cl-的胞内向胞外转运,增强GAB AAR的抑制性作用,起到缓解抑制炎性反应和中枢敏化的作用。本课题第一部分的研究表明,脊髓水平BDNF/trkB-KCC2信号通路参与了瑞芬太尼诱发手术后痛觉过敏的产生,但脊髓水平α7nAChRs的激活是否可以通过抑制BDNF/trkB-KCC2信号,从而缓解瑞芬太尼诱发的术后痛觉过敏,目前仍然没有确切的定论。瑞芬太尼诱发的术后痛觉过敏是一个持续性的过程,可长达术后数天或更长时间,这对于手术病人尤其是需要早期功能活动的病人术后恢复非常不利。但目前关于脊髓α7nAChRs激活对瑞芬太尼痛觉过敏时长的影响尚未见报道。所以本部分实验评估了 α7nAChRsII型正性变构激活剂(Positive allosteric modulators,PAMs)PNU-120596对瑞芬太尼痛觉过敏时长、以及脊髓背角BDNF/trkB-KCC2信号通路的影响:1、术前15min鞘内注射PNU-120596,并在术前 24h(基础值),术后的 4h,1d,2d,4d,7d,10d,12d,14d 和 21d 进行行为学测定,评估α7nAChRs激活对瑞芬太尼痛觉过敏时长的影响。2、通过对术前 24h(基础值),术后 4h,1d,2d,4d,7d,14d 的 BDNF、TrkB 和 KCC2表达变化的检测探讨α7nAChRs激活对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角BDNF/trkB-KCC2信号通路的影响。3、术前15min鞘内注射KCC2抑制剂VU0240551,并在术前 24h(基础值),术后的 4h,1d,2d,4d,7d,10d,12d,14d和21d进行行为学测定,进一步明确KCC2在α7nAChRs介导的抗痛觉过敏中的作用。结果显示:1、激活脊髓α7nAChRs可显著缓解瑞芬太尼诱发的术后痛觉过敏并缩短痛觉过敏的时长。2、术前15min鞘内注射PNU-120596,术后各时间点瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角BDNF和TrkB的表达显著下调,而KCC2的表达显著上调,且所有表达变化的时程缩短,与痛域的恢复时程基本一致。3、VU0240551可以明显抑制PNU-120596的抗痛觉过敏效果。综上所述,本实验明确了激活脊髓α7nAChRs对瑞芬太尼诱发大鼠术后痛觉过敏的时长和脊髓背角BDNF/trkB-KCC2信号通路的影响。我们的结果显示,脊髓α7nAChRs激活可以通过抑制脊髓背角BDNF/trkB-KCC2信号通路明显缓解瑞芬太尼诱发的术后痛觉过敏并缩短痛觉过敏的时长。这一结果为寻找合理治疗瑞芬太尼痛觉过敏的方案提供了新的理论和实验依据。