论文部分内容阅读
调节性T细胞（regulatory T cells,Treg cells）在维持机体的免疫耐受与免疫平衡等方面发挥着尤为重要的作用。叉头框P3蛋白（forkhead box P3,FOXP3）是Treg细胞关键的转录因子并且对Treg细胞的免疫抑制功能非常重要。转录因子FOXP3受多方面的调控,例如转录调控,蛋白复合体的调控,以及翻译后修饰水平上的调控,共同完善了Treg细胞的发育与功能机制。其中,FOXP3蛋白的翻译后修饰包括乙酰化、磷酸化与泛素化,影响着FOXP3与Treg细胞的稳定性与功能。近年来研究发现多个泛素连接酶或去泛素化酶调控FOXP3蛋白K48位多聚泛素化修饰,从而影响FOXP3蛋白与Treg细胞的功能,但我们对于FOXP3蛋白发生的其它类型的泛素化修饰却知之甚少。由于发生的位点与类型的不同,泛素化修饰不仅造成蛋白降解,也可能稳定蛋白的功能,因此,还有其它调控FOXP3蛋白泛素化修饰的酶有待发现。泛素连接酶MDM2（murine double minute 2）介导抑癌蛋白p53的泛素化修饰并使其降解,最近研究发现它也能负调控T细胞的激活,但它是否调控Treg细胞的功能并不清楚。此外,不同位点发生的磷酸化修饰能上调或下调FOXP3的功能。先前研究表明,Treg细胞展示了较高的AMPK（AMP-activated protein kinase）激活水平。在AMPK的激活剂二甲双胍处理后,小鼠淋巴结中Treg细胞的比例与数量均明显增加。虽然蛋白激酶AMPK与Treg细胞有一定的相关性,但AMPK作为一个能量感受器,能否调控Treg细胞的功能与代谢过程并不清楚。在第一部分的研究中,我们发现,MDM2通过对FOXP3蛋白进行泛素化修饰并增强其稳定性,从而正调控Treg细胞的功能。在人原代Treg细胞中敲低MDM2,CD25（白细胞介素-2（IL-2）受体的α链）与CTLA-4（cytotoxic T?lymphocyte antigen 4）的表达水平均显著降低,而产生细胞因子IL-2与IFN-γ（interferon-γ）的能力均显著增强。说明转录因子FOXP3对下游基因的调控能力减弱,并且Treg细胞在向效应T细胞（effector T cells,Teff cells,尤其是1类辅助性T细胞）的方向转变。与此相符的是,Treg细胞对Teff细胞增殖的抑制能力也减弱。与此同时,敲低MDM2的Treg细胞中FOXP3蛋白水平明显降低,说明敲低MDM2导致了FOXP3蛋白的不稳定。相反地,在Treg细胞中过表达MDM2,FOXP3蛋白的稳定性增强,其促进CD25与CTLA-4表达的能力以及抑制Teff细胞增殖的能力均增强。在机制上,MDM2与FOXP3蛋白相互作用,并主要介导了FOXP3蛋白的多位点单泛素化修饰与K63位多聚泛素化修饰,从而稳定了FOXP3蛋白的表达水平。我们也找到了FOXP3蛋白上能发生MDM2介导的泛素化的位点。此外,TCR/CD28信号的刺激可以上调Treg细胞中MDM2的表达水平及其介导的FOXP3泛素化修饰。我们发现MDM2可以正调控Treg细胞的免疫抑制活性,一方面,能更好地帮助我们理解MDM2、Treg细胞与肿瘤之间的关系;另一方面,也为治疗自身免疫性疾病提供了新的靶点。在第二部分的研究中,我们发现,蛋白激酶AMPK能与转录因子FOXP3相互作用,并对FOXP3蛋白进行磷酸化修饰,暗示了AMPK可能在Treg细胞中发挥一定作用。我们构建了在Treg细胞中特异性敲除AMPK的小鼠(Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl),并探索AMPK在Treg细胞中的功能。小鼠在稳态条件下,Treg细胞中AMPK的缺失并不影响免疫器官中效应T细胞的活化与细胞因子的产生,以及Treg细胞的比例。在小鼠饥饿模型中,饥饿两天后,Foxp3YFP-Cre小鼠脾脏中CD4+T和CD8+T细胞产生的细胞因子IFN-γ水平降低,而Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠脾脏中CD4+T和CD8+T细胞产生的细胞因子没有减少,说明缺陷型小鼠能抵抗饥饿处理导致的T细胞来源的细胞因子的减少。在甲型流感病毒感染后,Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠并没有明显的表型。在小鼠饥饿与甲型流感病毒感染模型中,饥饿刺激后,Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠更易被感染,而Foxp3YFP-Cre小鼠能抵抗甲型流感病毒的感染,并且后者肺中CD8+T细胞来源的IFN-γ与Granzyme B都显著升高,但Treg细胞的比例并没有明显变化,Treg细胞的抑制活性可能被削弱。对能量感受器与蛋白激酶AMPK在Treg细胞中的功能机理研究,有助于我们理解Treg细胞代谢与功能之间的关系,为靶向Treg细胞的疾病治疗提供新思路。