目的:心肌肥厚是多种心血管疾病的独立危险因素,包括心衰、心肌梗死、心律失常和心血管源性猝死。从代偿性心肌肥厚到失代偿心肌肥厚或心衰的转变是一个非常复杂的病理生理过程,其主要的特征包括心肌细胞的死亡,即凋亡的发生。在病理性心肌肥厚的过程中,凋亡最终可能会导致心肌功能组织减少,心室扩张或组织硬化。因此,有研究指出抑制心肌细胞的凋亡也许是阻止心脏从代偿性心肌肥厚向失代偿或心衰转变的颇具前景的治疗方向。他汀是一类在临床被广泛应用的降低胆固醇的药物,大量研究报道他汀还具有独立于降低血脂的多种功能,如改善血管内皮功能、抑制氧化应激、抑制炎症、提高动脉粥样硬化斑块的稳定性以及改善心肌肥厚和重构等。但是目前仍然没有一致的结论解释他汀药物对心肌保护的作用机制,甚至在部分作用机理上还具有一定争议。而他汀药物影响心肌细胞代谢和线粒体相关调控蛋白的作用也是近来研究的热点之一。增强子结合蛋白C/EBPβ(CCAAT/enhancer-binding proteinβ)是C/EBP转录因子家族成员之一,其主要功能是调控细胞增殖、分化基因的转录。有研究发现运动刺激可以明显下调心肌细胞中C/EBPβ的表达,并认为C/EBPβ在心肌组织生理性肥厚和增生中有着非常重要的作用。近来又有研究报道C/EBPβ在病理性的心肌肥厚中同样具有调节作用,C/EBPβ基因的表达被敲减后可以缓解苯肾上腺素诱导的心肌肥厚反应。但相关研究还较少,具体调控机制还有待揭示。此外,心脏作为高耗能的器官,正常的线粒体能量代谢功能对维持心脏功能具有非常重要作用,当心肌肥厚或心衰发生时,线粒体能量代谢功能也开始改变或遭到损伤。但是,阿托伐他汀是否能通过C/EBPβ抑制心肌肥厚和保护线粒体代谢功能尚未有相关报道。本研究的目的是探究阿托伐他汀抑制病理性心肌肥厚和细胞凋亡的作用机制,以及是否通过调节C/EBPβ的表达发挥其相关作用。该研究结果也许能提供解释阿托伐他汀对心血管系统多样保护作用的新方向。研究方法:第一部分:培养H9c2心肌细胞,分别用不同浓度的血管紧张素II(AngII,0.01,0.1,1,10μM)和阿托伐他汀(1,10,20,50μM)干预细胞24小时,采用MTS法测定不同浓度药物对心肌细胞活力的影响,筛选最佳药物干预浓度。鬼笔环肽荧光染色心肌细胞骨架蛋白,观察细胞形态变化。通过质粒转染的方式,将flag-C/EBPβ转染进H9c2心肌细胞,使之过表达C/EBPβ。流式细胞仪凋亡检测各组心肌细胞处于早期凋亡和晚期凋亡的比率。Western blot方法检测心肌肥厚标志蛋白ANP和BNP、C/EBPβ、PGC-1α、凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。采用免疫荧光检测PGC-1α在细胞胞质中的表达情况。罗丹明123荧光染色方法检测线粒体膜电位的变化,并用荧光酶标仪测定荧光强度。第二部分:阿托伐他汀对自发性高血压大鼠(SHR)心肌肥厚的作用。动物实验:选取11周龄的SHR雄性大鼠和同周龄的WKY雄性大鼠为实验对象。实验一共分为3组,对照组为WKY大鼠8只,心肌肥厚模型组为SHR大鼠8只,阿托伐他汀干预组为SHR大鼠8只。干预组每日一次按体重灌胃给予10mg/kg的阿托伐他汀药物悬浊液,对照组和模型组按体重灌胃给予同等体积的蒸馏水。每周称量一次体重,每周使用小动物无创血压仪测量各组大鼠尾部收缩压、舒张压及心率至少一次。16周龄时,用心脏超声多普勒仪评价大鼠心脏左室室壁厚度和心功能状态。观察离体心脏大体外观,去掉所有心房及右心室组织后,称量带有室间隔的整个左室重量,计算LVM/BW比值。Masson组织切片染色评价大鼠心肌组织重构或纤维化程度。Western blot方法检测心肌肥厚标志蛋白ANP和BNP、C/EBPβ、PGC-1α、UCP3、凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。免疫组化染色检测大鼠心肌组织切片C/EBPβ和UCP3的表达情况。TUNEL法检测大鼠心肌组织切片中心肌细胞凋亡情况。结果:第一部分:1、根据MTS细胞活力测定和心肌肥厚标志蛋白BNP的表达情况,最终选用1μM AngII刺激H9c2细胞24小时造心肌肥厚模型,10μM阿托伐他汀干预。2、鬼笔环肽染色和Western blot显示H9c2心肌肥厚模型组平均细胞面积明显增加,心肌肥厚标志蛋白ANP和BNP、C/EBPβ的蛋白表达水平上升,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比率明显下降。而经10μM阿托伐他汀干预24小时后,显著降低细胞平均面积,及ANP、BNP、C/EBPβ的蛋白表达水平,并逆转了Bcl-2/Bax蛋白表达比率的下降。3、阿托伐他汀还能显著抑制心肌细胞凋亡,恢复线粒体膜电位和线粒体发生的调控蛋白PGC-1α表达。4、当通过质粒转染使心肌细胞过表达C/EBPβ,与阴性对照组相比,转染组表现为心肌肥厚特征,包括ANP、BNP、C/EBPβ的蛋白表达水平升高,细胞凋亡率上升,Bcl-2/Bax蛋白表达的比率、线粒体膜电位和PGC-1α表达水平均下降。并且C/EBPβ的过表达减弱了阿托伐他汀对肥厚心肌细胞的保护效应。第二部分:1、16周龄时,WKY对照组、SHR模型组和SHR干预组三组大鼠的平均动脉压分别为103.6±6.1,151.8±12.5和159.1±6.2 mmHg,其中模型组和干预组血压值没有统计学差异。2、对各组大鼠行心脏超声检查,结果显示SHR模型组的大鼠具有最高的室间隔厚度(IVSd)和左室后壁厚度(PWTd),表现出明显的心肌肥厚状态,平均左室质量/体重比明显高于对照组,但心功能指数没有明显差异。Masson染色也显示SHR心肌组织发生纤维化和重构的程度最重。3、SHR经过6周的阿托伐他汀干预,左心室壁的肥厚和纤维化程度明显减轻,IVSd和PWTd均比SHR模型组降低。4、Western blot检测结果显示在SHR模型组ANP、BNP和C/EBPβ蛋白表达水平明显增高。心肌组织切片的免疫组化也显示C/EBPβ的平均累积光密度在SHR模型组是最高的,不仅在心肌细胞胞质增加,还在细胞核内浓集。而10mg/kg阿托伐他汀干预6周后,能明显降低ANP、BNP和C/EBPβ的蛋白表达水平。5、TUNEL凋亡分析检测发现SHR心肌肥厚组织TUNEL阳性细胞比率明显增高,同时伴有凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达比率的下降。他汀干预后,不仅逆转了下调的Bcl-2/Bax表达比率,还降低了组织切片中TUNEL阳性细胞比率。6、免疫组化结果显示线粒体膜上蛋白UCP3在SHR心肌肥厚组表达明显降低,同样地,Western blot发现PGC-1α和UCP3的蛋白表达水平也明显降低。而阿托伐他汀的干预能显著地抑制肥厚心肌组织中PGC-1α和UCP3表达的降低。结论:通过体外和体内实验,我们进一步证实了阿托伐他汀对AngII诱导的H9c2心肌细胞肥厚和SHR高血压诱导的心肌肥厚的保护作用,包括抑制心肌肥厚和重构、改善线粒体膜电位、上调线粒体发生和代谢相关调控因子、以及抑制细胞凋亡的发生。转录增强结合蛋白C/EBP?在病理性心肌肥厚中的高表达能通过影响线粒体膜电位和线粒体相关调控因子,促进心肌细胞凋亡的发生。而阿托伐他汀抑制心肌肥厚和凋亡的保护功能也许部分归因于下调了C/EBP?的表达。因此,C/EBPβ/PGC-1α/UCP3相关的信号通路也许是阿托伐他汀对心血管系统多种保护效应的一条新的解释路径。而包括C/EBPβ因子在内的该信号通路也许是病理性心肌肥厚中维持线粒体功能和抑制细胞凋亡的新的治疗靶点。