狂犬病是嗜神经性狂犬病病毒(RV)感染哺乳动物中枢神经系统而引起的急性、致死性传染病,造成全球每年有50,000—59,000人死亡,但病例主要集中在亚洲和非洲。在狂犬病病毒感染的野生和家养宿主中,狗仍然被视为亚洲和非洲狂犬病的主要宿主。该病毒经伤口感染后,沿周围神经逆轴浆侵入中枢,引起细胞凋亡、氧化应激,线粒体功能障碍,并通过劫持TLR3而抑制宿主的先天性免疫反应。应用狂犬病病毒固定株的体内外神经元感染实验表明,该病毒引起树突和轴突的退行性改变,而这些病理变化与神经元细胞骨架密切相关。细胞骨架对细胞除起结构支撑作用外,微管和微丝动态变化还调节神经细胞生长、物质运输和细胞信号传导等多种功能。然而,无论神经元的两种细胞骨架单独或协同作用,均受构成这两种骨架的骨架相关蛋白严格调控,特别是维持神经元的正常结构和树突棘形态,在该过程中一些关键蛋白起主要作用。树突棘是维持神经正常传导功能和兴奋性突触后膜的结构基础,肌动蛋白为其主要骨架类型。狂犬病病毒借助网格蛋白实现内吞并侵入细胞,其后形成的早期和晚期囊泡蛋白通过与肌动蛋白和微管的交互作用,完成侵袭过程,导致神经元坏死和变性,因此出现神经功能异常。鉴于狂犬病病毒和一些其他病毒经肌动蛋白-微管骨架借助内体途径传输,因此,本研究旨在观察狂犬病病毒感染后肌动蛋白和微管相关结合蛋白的动态变化及早、晚期囊泡上的GTP酶蛋白与狂犬病病毒的共定位等,分析狂犬病病毒在神经元内的传输机制,为狂犬病病毒感染导致的神经功能异常提供实验数据。本研究分为三部分。第一部分,感染神经元细胞,然后用Rab5、EEA1、LAMP1、Rab7等囊泡表面特异性标记物抗体,免疫荧光检测这些标志抗体全部或其中一些与RV是否存在共定位,并通过RNA干扰下调这些标志分子,研究其对于RV感染的影响。第二部分,在RV感染的神经元上,应用实时定量PCR和Western blot印迹对微丝结合蛋白和微管相关蛋白,特别是微管正极端结合EB3和p140cap等进行了基因和蛋白表达水平检测,并应用免疫荧光观察了这些变化对树突和轴突骨架的影响。在第三部分,应用免疫组织化学和组织病理学方法,对RV感染小鼠脑组织不同部位的抗原分布和病理变化进行了研究。同时还对肌动蛋白结合蛋白也进行了定量。这些研究结果可用于分析RV街毒株感染神经元的胞体和周质变化。所有数据分别均采用SPSS和ANOVA,以确定对照组和实验组间的统计学差异,相对定量分析以大于2倍作为显著性范围。结果表明,RV核蛋白与Rab5和Rab7在N2a细胞的细胞质中共定位,RNA干扰下调Rab5和Rab7表达时,在感染早期核蛋白和RV滴度均显著降低。实时定量PCR检测发现,微管末端蛋白(EB3和p140cap)和肌动蛋白相关蛋白(pfn1,tesk1和LIMK1)均下调,肌动蛋白相关蛋白(cfll 3,GSN,PPP3CA,SSH1,katnal)等上调。两个不同RV毒株RV感染均显著下调EB3和p140cap基因表达并减少其相应的蛋白含量,造成微管连续性破坏,呈散乱分布。组织病理学和免疫组化显示,小鼠大脑不同区域均有病毒抗原分布,大脑可作为病理诊断或病料采集的最佳点。组织病理显示,神经元细胞轻度坏死和空泡化。这些结果说明狂犬病病毒通过改变细胞骨架相关蛋白而造成骨架结构被破坏,而从引起神经元退化和神经功能异常。本研究结果初步提示,狂犬病病毒感染使微管和肌动蛋白相关蛋白下调,进而引起细胞骨架结构的完整性被破坏,造成神经元变性和退行性改变,从而引起突触功能障碍,表现出神经功能异常。